用慢病毒載體介導癌基因建立細胞衰老的模型.pdf

1、癌基因的活化是腫瘤發(fā)生過程中的關鍵環(huán)節(jié)，發(fā)生了持續(xù)活化型突變的RAS癌基因（H-rasV12）在與其他癌基因共同表達時能有效轉化嚙齒類動物的細胞；然而其單獨表達卻在一系列哺乳動物細胞中引發(fā)一種類似于細胞衰老的反應。Serrano等于1997年的Cell雜志首次報道了這種癌基因活化誘導細胞衰老（oncogene-induced cellular senescence，OIS)的現象。其后，多種癌基因的活化以及抑癌基因的失活也相繼被發(fā)現能誘

2、導細胞的衰老反應。
　　原癌基因發(fā)生異常活化的細胞是潛在的癌細胞，通過OIS機制可以將此類細胞引向衰老而不再增殖，因此OIS一經發(fā)現就被認為是一種可能的抑癌機制。這一現象首先發(fā)現于體外培養(yǎng)的細胞中，2005年Michaloglou等報道，普遍存在于人類皮膚表面的“痣”是由衰老的黑素細胞構成，且這些細胞均帶有BRAF癌基因的激活型突變，從而證明了OIS作為一種體內普遍存在的保護性機制是阻止腫瘤發(fā)生的一道屏障。本文以慢病毒為載體介導持

3、續(xù)活化型的H-rasV12癌基因，重復了Serrano等于1997年建立的OIS的經典模型。
　　本實驗分為三部分：
　　1.建立過氧化氫和順鉑誘細胞衰老的模型。過氧化氫和順鉑，分別作為氧化應激和DNA損傷應激均有文獻報道能誘導細胞衰老。我們查閱文獻后通過反復摸索藥物濃度、處理時間，建立了誘導細胞衰老的模型。細胞的衰老狀態(tài)的檢測選擇SA-β-gal染色和EdU摻入檢測DNA合成兩種指標。我認為和以往的文獻相比，我們的方法更為

4、簡便和快速。
　　2.慢病毒載體的改構。我們從美國Addgene網站以共享的方式定購了慢病毒包裝系統(tǒng)，實驗中我們發(fā)現這套系統(tǒng)具有高效性的特點，但該慢病毒載體質粒中并不含有任何真核細胞抗生素篩選標記，這就為感染后用抗生素篩選穩(wěn)定整合的細胞造成了困難。為此我們對該慢病毒載體進行了改造，通過將抗生素抗性基因克隆入該慢病毒載體，實現了病毒感染后的抗生素篩選，為下一步研究提供了方便。
　　3.用慢病毒載體介導癌基因誘導細胞衰老。在改構