FANCD2 shRNA干擾對頭頸鱗癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞化療敏感性的影響和機制研究.pdf

1、 目的：頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(Head and Neck Squamous Cell Carcinoma, HNSCC)的發(fā)病率在全身腫瘤中居第六位。由于頭頸部重要器官集中,淋巴結(jié)豐富,故HNSCC的頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移使手術(shù)和放化療的療效受到制約。目前化療已在頭頸腫瘤尤其是發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進展期患者的臨床治療中廣泛應(yīng)用。然而原發(fā)或獲得性耐藥的產(chǎn)生降低了HNSCC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的療效。范可尼貧血(Fanconi anemia, FA)通路功能障

2、礙能夠改變腫瘤對DNA交聯(lián)劑的敏感性,FANCD2作為FA通路的關(guān)鍵基因可能對腫瘤細(xì)胞生長及化療敏感性的影響起重要作用。本研究擬通過應(yīng)用shRNA干擾獲得的FANCD2沉默效應(yīng)穩(wěn)定的HNSCC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移HSC-4細(xì)胞系,研究FANCD2對HNSCC生長活性的可能作用并探討沉默F(xiàn)ANCD2表達(dá)對HNSCC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞化療敏感性的影響及相關(guān)機制。方法：利用前期實驗成功獲得的FANCD2 shRNA沉默的HNSCC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移HSC-4

3、細(xì)胞系,將實驗細(xì)胞分為空白對照組：HSC-4(未經(jīng)任何處理的野生型HSC-4細(xì)胞),陰性對照組：FANCD2-shRNA-C(含F(xiàn)ANCD2無效干擾序列的HSC-4細(xì)胞)和實驗組：FANCD2-shRNA(前期實驗成功構(gòu)建含F(xiàn)ANCD2有效干擾序列且FANCD2穩(wěn)定沉默的HSC-4細(xì)胞)三組。經(jīng)細(xì)胞傳代,嘌呤霉素篩選,免疫印跡法(Western Blot)檢測FANCD2基因沉默效應(yīng),計算沉默效率。細(xì)胞增殖抑制試驗(Cell Count

4、ing Kit-8,CCK-8法)檢測FANCD2shRNA干擾后HSC-4細(xì)胞的生長增殖情況,流式細(xì)胞術(shù)(Annexin V/PI染色法 ) 測 定 其 凋 亡 和 細(xì) 胞 周 期 改 變 ； CCK-8 法 檢 測 順 鉑(Cis-diamminedichloroplatinum,CDDP)在不同時間點及不同濃度作用于HSC-4細(xì)胞的抑制率,并計算IC50值,流式細(xì)胞術(shù)測定CDDP作用后其凋亡和細(xì)胞周期改變以研究FANCD2 shR

5、NA干擾對HSC-4細(xì)胞化療敏感性的影響。通過Western Blot檢測FANCD2 shRNA干擾后Bax、ERK1/2、P-ERK1/2和integrinβ1蛋白表達(dá)變化來探討FANCD2與上述蛋白的功能關(guān)系；檢測三組細(xì)胞DNA交聯(lián)劑作用后上述通路蛋白表達(dá)的變化,研究FNACD2 shRNA沉默影響化療敏感性的可能機制。結(jié)果：(1)Western Blot證實HNSCC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移HSC-4細(xì)胞存在FANCD2蛋白的表達(dá)；前期實驗

6、設(shè)計的干擾序列使FANCD2沉默效應(yīng)穩(wěn)定,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=514.179, P<0.05),沉默效率為86%；(2)CCK-8結(jié)果顯示shRNA沉默F(xiàn)ANCD2表達(dá)能抑制HSC-4細(xì)胞增殖,且抑制效應(yīng)具有時間依耐性。不同濃度CDDP作用48小時,三組細(xì)胞抑制率均隨濃度增加而增高,各濃度組間(F=1247.992, P<0.05)和各細(xì)胞組間(F=118.724, P<0.05)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,且實驗組抑制率增加較對

7、照組明顯；16μg/mlCDDP作用24、48、72小時,三組細(xì)胞抑制率均隨時間延長而增高,各時間組間(F=575.013, P<0.05)和各細(xì)胞組間(F=37.709, P<0.05)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,且實驗組抑制率增加較對照組明顯；實驗組細(xì)胞CDDP的IC50值(16.633±1.137)μg/ml比空白對照組(34.567±1.193)μg/ml和陰性對照組(30.400±0.089)μg/ml明顯降低(F=229.887,

8、P<0.05)；(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)三組細(xì)胞培養(yǎng)72小時后,實驗組HSC-4細(xì)胞凋亡率(13.33%)較空白對照組(1.69%)和陰性對照 組(5.05%)明顯增高(F=403.277, P<0.05)；FANCD2 shRNA干擾后細(xì)胞周期變化為G0/G1期比例增加,進入S期細(xì)胞減少(F=307.896, P<0.01)。0、2、5μg/ml CDDP作用48小時,實驗組細(xì)胞凋亡率較空白對照組和陰性對照組增高( F0μg/ml =

9、137.335, P<0.05；F2μg/ml =581.633, P<0.05；F5μg/ml=289.719, P<0.05),且凋亡率隨藥物濃度的增加而增高；細(xì)胞周期G0/G1期比例隨CDDP濃度增加而增高,且實驗組G0/G1期細(xì)胞比例與空白對照組和陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F0μg/ml =4178.897, P<0.05；F2μg/ml=33.864, P<0.05；F5μg/ml=27.243, P<0.05)；(4)

10、Western Blot結(jié)果顯示shRNA沉默F(xiàn)ANCD2表達(dá),實驗組Bax(F=15.168, P<0.05)和ERK1/2(F=14.888, P<0.05)蛋白表達(dá)較對照組增強,P-ERK1/2(F=35.288, P<0.05)和integrinβ1(F=2.583, P<0.05)蛋白表達(dá)降低；2μg/ml CDDP作用48小時后,實驗組Bax(F=25.218, P<0.05)和ERK1/2(F=30.345, P<0.05

11、)蛋白表達(dá)較對照組增強,P-ERK1/2(F=50.201, P<0.05)和integrinβ1(F=22.227, P<0.05)蛋白與對照組相比表達(dá)降低。結(jié)論：(1)HNSCC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移HSC-4細(xì)胞系中存在FANCD2基因表達(dá),且FANCD2基因shRNA沉默效應(yīng)在HSC-4細(xì)胞中穩(wěn)定存在；(2)shRNA干擾沉默F(xiàn)ANCD2表達(dá)能夠抑制HSC-4細(xì)胞增殖,促進其凋亡并導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯,提示FACND2可能與HNSCC的生長活

12、性有關(guān),這為下一步研究FANCD2基因功能及相關(guān)機制奠定了實驗基礎(chǔ)；(3) shRNA干擾沉默F(xiàn)ANCD2表達(dá)能提高人HNSCC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移HSC-4細(xì)胞對DNA交聯(lián)劑CDDP的化療敏感性；(4)FANCD2基因可能參與Bax誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)通路促進HSC-4細(xì)胞凋亡；ERK1/2表達(dá)增強激活了磷酸化途徑,聯(lián)合P-ERK1/2和integrin β1蛋白表達(dá)下調(diào),可能與FANCD2共同作用抑制 HSC-4細(xì)胞增殖,促進凋亡并導(dǎo)致細(xì)胞周期