P203L和V395I突變?cè)贜OK介導(dǎo)的腫瘤生成與轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、受體型酪氨酸激酶是存在于機(jī)體內(nèi)一類(lèi)具有廣泛生理調(diào)節(jié)作用的蛋白酶類(lèi)，它們調(diào)控著細(xì)胞許多生理生物學(xué)活動(dòng)，包括細(xì)胞的增殖與分化、細(xì)胞的周期調(diào)控與代謝、胚胎的形成于發(fā)育等等。NOK(Novel Oncogene with Kinase Domain)是一個(gè)最新被鑒定的受體型酪氨酸激酶。NOK因缺少完整的胞外結(jié)構(gòu)域和DFG結(jié)構(gòu)域而因此被認(rèn)為是一類(lèi)不具備生物學(xué)活性的假激酶。盡管如此，我們實(shí)驗(yàn)室通過(guò)前期工作發(fā)現(xiàn)，NOK是一個(gè)癌基因，能在體內(nèi)誘導(dǎo)癌癥的

2、發(fā)生和轉(zhuǎn)移。目前，關(guān)于NOK的研究并不多，其導(dǎo)致腫瘤生成和轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制也不清楚。本研究旨在從NOK基因結(jié)構(gòu)出發(fā)，尋找其結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)聯(lián)性，明確NOK導(dǎo)致腫瘤生成和轉(zhuǎn)移的信號(hào)通路，為闡明其分子機(jī)制，為癌癥的診斷和治療提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　本研究利用體外定點(diǎn)突變技術(shù)克隆構(gòu)建了含有不同位點(diǎn)突變和結(jié)構(gòu)域突變的共九個(gè)NOK突變子，并分別構(gòu)建了pCDNA3.0-NOK-HA/NOK-Mutant-HA真核表達(dá)質(zhì)粒和pCDH-CM

3、V-MCS-EF1-GFP-CD511B-NOK-HA/NOK-Mutant-HA慢病毒包裝質(zhì)粒及相應(yīng)BaF3穩(wěn)定細(xì)胞系。
　　我們首先檢測(cè)了STYK1（即P203L突變）和V395I突變對(duì)自身磷酸化水平和激酶活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)STYK1和V395I突變均未影響到NOK的激酶活性，但V395I輕微抑制了自身的磷酸化。隨后，我們研究了突變對(duì)信號(hào)通路的影響。在HEK293T細(xì)胞中，NOK的高表達(dá)能顯著性升高ERK和Akt的磷酸化程度

4、。但突變V395I并未削弱NOK所介導(dǎo)的ERK和Akt的磷酸化，而突變STYK1則抑制了這兩條信號(hào)通路。并且，兩者都抑制了諸如STAT1、STAT3和STAT5的磷酸化活化。在HeLa細(xì)胞中，STYK1同時(shí)抑制了ERK和Akt的磷酸化，但V395I僅抑制了ERK的磷酸化。而在JAK-STAT這條信號(hào)通路中，STYK1和V395I均抑制了STAT1和STAT3的磷酸化水平，但是對(duì)STAT5的影響不明顯。最后，在穩(wěn)定細(xì)胞系中，我們發(fā)現(xiàn)突變S

5、TYK1和V395I不僅顯著性地抑制了STAT1、STAT3和STAT5的磷酸化，而且還抑制了ERK的磷酸化。同時(shí)，STYK1而非V395I顯著性地降低了NOK的磷酸化水平。細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)了突變對(duì)細(xì)胞增殖的影響。發(fā)現(xiàn)STYK1和V395I抑制了細(xì)胞的增殖能力。我們還發(fā)現(xiàn)與NOK相比，STYK1組誘導(dǎo)的集落形成數(shù)量明顯降低，約為NOK組的1/35，V395I組的集落形成數(shù)量也有降低，約為NOK組的1/4。以上結(jié)果說(shuō)明了突變STYK1和V

6、395I抑制了NOK介導(dǎo)的細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化及相關(guān)信號(hào)的傳導(dǎo)。
　　在動(dòng)物模型中，我們研究了NOK及其突變體在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力和相應(yīng)的腫瘤轉(zhuǎn)移能力。發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組細(xì)胞相比，實(shí)驗(yàn)組均可以導(dǎo)致腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移，但和NOK組的成瘤能力相比，突變組導(dǎo)致腫瘤形成的能力減弱，腫瘤形成的時(shí)間明顯滯后。在實(shí)驗(yàn)組中，NOK組裸鼠平均存活時(shí)間約為1.5月，而STYK1組和V395I組裸鼠平均存活時(shí)間約延長(zhǎng)至2.5-3.0月。各臟器腫大情況以NOK組最為

7、明顯，其中肝臟和脾臟的腫大較STYK1組和V395I組嚴(yán)重。在NOK組裸鼠的肝臟表面可見(jiàn)明顯結(jié)節(jié)狀腫瘤轉(zhuǎn)移灶甚至成片轉(zhuǎn)移灶，而在注射突變子的裸鼠肝臟表明則很少看到明顯轉(zhuǎn)移灶的產(chǎn)生。蘇木精-伊紅(HE)染色發(fā)現(xiàn)，在V395I和STYK1中，V395I組肝臟和脾臟的浸潤(rùn)程度均高于STYK1組。我們利用流式細(xì)胞儀分析了各臟器中腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，并進(jìn)行了腫瘤轉(zhuǎn)移的相對(duì)定量分析，結(jié)果也顯示了各臟器腫瘤侵襲的不同情況。
　　此外，利用免疫沉淀和

8、質(zhì)譜鑒定技術(shù)，我們研究了與NOK可能發(fā)生相互作用的蛋白。用質(zhì)譜技術(shù)鑒定到了約40余種有可能與NOK發(fā)生相互作用蛋白，并且這些蛋白都是功能研究比較少的，其中有至少1/4為未知功能蛋白。包括MYO9，MYO10，MYO14，F(xiàn)LNA，EHILI，BCLF1，MCM5，LAS1L，F(xiàn)AS，MYO6，U520和DZSP等等，其中不乏與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白如MYO10和MYO6等。這些蛋白可能在NOK介導(dǎo)的腫瘤生成和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。