蠶絲人工韌帶復合骨髓基質(zhì)干細胞的實驗研究.pdf

1、目的:
　　 利用自制的蠶絲人工韌帶支架，多種方法對表面結構進行改性，觀察對比不同分組間種子細胞粘附、生長情況，為組織工程化人工韌帶支架材料與種子細胞復合提供一種理想的方法。
　　 方法:
　　 蠶絲人工韌帶支架材料，采用胰酶、碳酸鈉聯(lián)合脫膠，稱重測韌帶脫膠率，以EDC（1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳二亞胺）/NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)作為交聯(lián)劑進行膠原的交聯(lián)，酶標儀法測其交聯(lián)度。采用熒光顯微鏡、掃描電鏡

2、觀察蠶絲脫膠及與交聯(lián)膠原復合后的表面結構變化。
　　 把韌帶支架分為試驗組、參照組和空白對照組。參照組蠶絲人工韌帶與膠原結合形成蠶絲-膠原結合韌帶支架，不做交聯(lián)處理;試驗組采用EDC/NHS對蠶絲-膠原結合韌帶支架材料進行交聯(lián);空白組未作任何處理。兔的骨髓基質(zhì)干細胞(Marrowmesenchymalstemcells，MSCs)全血貼壁法培養(yǎng)至第八代，通過CD34、CD44、CD50免疫組化及流式細胞儀進行干細胞檢測，調(diào)整細胞

3、密度為1×106/L，分別種植于三種支架材料上，對三種材料表面培養(yǎng)的細胞進行了熒光顯微鏡、掃描電鏡及酶標儀的檢測。比較不同分組間細胞粘附、增殖生長情況。
　　 結果:
　　 采用胰酶、碳酸鈉聯(lián)合脫膠，能將絲膠基本去除，脫膠率29％左右。當EDC濃度為3g/L時，交聯(lián)度最大。熒光顯微鏡下未脫膠蠶絲表面比較完整;脫膠蠶絲結構變得蓬松，表面光滑，絲素纖維暴露。SEM觀察，未脫膠蠶絲表面粗糙不平，絲膠包繞在絲素纖維周圍;脫膠完全

4、的蠶絲表面很光滑，可見單根的絲素纖維。熒光倒置顯微鏡及SEM下復合膠原后的韌帶可見，膠原呈一薄層分布在韌帶表面，呈不規(guī)則的線狀突起，色澤較白。交聯(lián)后膠原-蠶絲韌帶成蜂窩狀。
　　 全血貼壁法體外培養(yǎng)的BMSC，檢測CD34陰性、CD44、CD50、STRO-1陽性，流式細胞儀檢測CD34+細胞占10％左右;CD44+占42％左右，表現(xiàn)為干細胞特性。熒光顯微鏡下，未交聯(lián)膠原-蠶絲韌帶細胞數(shù)目較少，細胞未見舒展;交聯(lián)后的膠原-蠶絲人

5、工韌帶，蠶絲表面粗糙，細胞粘附率較高，舒展充分，蠶絲之間的間隙模糊。SEM下見，交聯(lián)后的蠶絲人工韌帶與細胞貼合緊密，細胞伸展充分，有較多的觸角伸出，明顯優(yōu)于其它組。經(jīng)單因素方差分析，試驗組與參照組、空白對照組比較P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結論:
　　 1.骨髓基質(zhì)干細胞能夠向多種組織細胞分化，在實驗中表現(xiàn)出良好的增殖能力，是種子細胞的理想選擇。
　　 2.膠原蛋白具有良好的生物相容性，是一種良好的蠶

6、絲表面修飾劑。EDC毒性很低，可作為良好的交聯(lián)劑。
　　 3.經(jīng)過EDC/NHS交聯(lián)的蠶絲-膠原結合韌帶支架材料，能夠顯著提高細胞黏附率。
　　 意義:
　　 隨著人們物質(zhì)文化水平的不斷提高和體育事業(yè)的蓬勃發(fā)展，韌帶損傷病例呈現(xiàn)快速增長的趨勢。韌帶損傷后，往往需要韌帶重建手術治療。目前韌帶移植材料有①自體韌帶;②異體韌帶;③人工韌帶，都存在來源少，免疫排斥及傳播疾病的缺陷。組織工程人工韌帶的發(fā)展，為治療韌帶損傷提