P162通過(guò)抑制CHK1-2表達(dá)來(lái)增加食管癌細(xì)胞株Eca109放射敏感性的研究.pdf

1、分類號(hào)：U D C ：密級(jí)：猷漠神撥夫·肇學(xué)位論文P 1 6 2 通過(guò)抑制C H K l ／2 表達(dá)來(lái)增加食管癌細(xì)胞株E c a l 0 9 放射敏感性的研究T h eR e s e a r c ho fP 1 6 2 I n c r e a s eR a d i o s e n s i t i v i t yo fT h eE s o p h a g e a lC a n c e rC e l lL i n e s E c

2、a l 0 9b y ‘I n h i b i t i n g ’C h k l ／2 E x p r e s s i o n張 紅指導(dǎo)教師姓名：申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：論文定稿日期：學(xué)位授予單位：學(xué)位授予日期：吳清明教授答辯委員會(huì)主席： 余保平教授評(píng) 閱 人：武漢科技大學(xué)碩士學(xué)位論文 第1 頁(yè)摘要目的：細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶l ( C h k l ) 和細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶2 ( C h k 2 ) 是D N A 損傷修復(fù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中非常重要的蛋白

3、激酶。全新多肽P 1 6 2 對(duì)食管癌細(xì)胞株E c a l 0 9 有明顯的抗癌、放射增敏作用。它是否通過(guò)抑制細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增加食管癌細(xì)胞株的放射敏感性呢? 本文擬檢測(cè)它對(duì)C h k l 和C h k 2 是否有抑制作用、對(duì)細(xì)胞周期的影響來(lái)進(jìn)一步了解其放射增敏的機(jī)制。方法：1 、誘導(dǎo)抗拒株E c a l 0 9 R 的形成：采用小劑量放射線反復(fù)照射E c a l 0 9 細(xì)胞株，累計(jì)照射劑量達(dá)至' J 6 0 G y

4、 ，使其初步具有放射抗拒性；2 、應(yīng)用M T T 法檢N 2 、4 、6 、8 G y 放射劑量對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，確定最合適的放射劑量；3 、C C K 一8 法檢N 5 、1 0 、2 0 、4 0 、6 0 m g ／L 不同濃度的P 1 6 2 對(duì)E c a l 0 9 R 細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制率，以明確P 1 6 2 最佳實(shí)驗(yàn)濃度；4 、免疫熒光法檢鋇J J C h k l 與C h k 2 在細(xì)胞株中的陽(yáng)性表達(dá)；5 、將實(shí)驗(yàn)分為

5、不j J [ I P l 6 2 不照射組、j J [ I P l 6 2 不照射組、不j J [ I P l 6 2 照射組及j J [ I P l 6 2 照射四大組，每組分別包含E c a l 0 9 及E c a l 0 9 R - - 種細(xì)胞株；6 、W e s t e r nb l o t 檢測(cè)四組細(xì)胞株中C h k l 與C h k 2 蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化；7 、流式細(xì)胞儀檢測(cè)四組細(xì)胞株細(xì)胞周期的變化。結(jié)果：1 、將細(xì)胞株

6、未經(jīng)照射組及照射2 、4 、6 、8 G y 組消化鋪板，制成單細(xì)胞懸液，以未照射組為對(duì)照組，2 、4 、6 、8 G y 為實(shí)驗(yàn)組，分別在2 4 h 、4 8 h 、7 2 h N ' J O D 值，計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，達(dá)到半數(shù)抑制率的劑量為后期實(shí)驗(yàn)的合適劑量。測(cè)得在6 G y 的放射劑量時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率在5 0 ％左右，故取6 G y 為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的放射劑量。2 、C C K 一8 選取E c a l 0 9 R 的最

7、適的藥物濃度，以5 、1 0 、2 0 、4 0 、6 0 m g ／L 為實(shí)驗(yàn)組，不加藥組為對(duì)照組，在2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 瀕J J O D 值，計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，達(dá)到半數(shù)抑制率的濃度為后期試驗(yàn)的藥物濃度。測(cè)得P 1 6 2 在2 0 m g ／L 的濃度下，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率在5 0 ％左右，故后續(xù)試驗(yàn)的濃度選取2 0 m g ／L ．另外，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程發(fā)現(xiàn)，隨著P 1 6 2 齊, J 量加大，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率增加，

8、說(shuō)明P 1 6 2 對(duì)細(xì)胞抑制作用與劑量呈正相關(guān)。3 、免疫熒光顯示：食管癌E c a l 0 9 及E c a l 0 9 R 細(xì)胞株中都存在少量的C h k l 及C h k 2 表達(dá)，在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，而且E c a l 0 9 R 細(xì)胞株中C h k l 、C h k 2 的平均熒光強(qiáng)度高于E c a l 0 9 細(xì)胞株，提示E c a l 0 9 R 中C h k l 、C h k 2 的表達(dá)高于E c a l 0