ERCC1、ERCC2在食管癌細(xì)胞株中的表達(dá)及與順鉑、紫杉醇敏感性相關(guān)研究.pdf

1、目的：ERCC1(excision repair cross complementing1)和ERCC2(excision repair cross complementing2)即核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1和2，兩者分別在DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮受損DNA 5’端外切和雙鏈解螺旋作用。大量文獻(xiàn)和臨床資料已經(jīng)證實(shí)兩者表達(dá)水平上調(diào)是鉑類化療藥物耐藥的重要分子基礎(chǔ)。同時(shí)有資料顯示ERCC2蛋白水平與抗有絲分裂劑紫杉醇敏感性呈顯著負(fù)相關(guān)。尚無(wú)其

2、mRNA水平與紫杉醇敏感性相關(guān)報(bào)道。順鉑和紫杉醇為經(jīng)典化療藥物，在食管癌化療中起著舉足輕重的作用，但化療并非對(duì)所有患者都有效。如何篩選出化療敏感個(gè)體，減少陪療人群，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化化療是目前研究熱點(diǎn)。本研究通過(guò)測(cè)定6株常見(jiàn)食管鱗癌細(xì)胞株中ERCC1和ERCC2 mRNA水平表達(dá)，比較其表達(dá)水平與順鉑、紫杉醇藥物敏感性的關(guān)系。并進(jìn)一步研究了siRNA下調(diào)ERCC2表達(dá)后順鉑和紫杉醇敏感性的變化。以求在食管癌細(xì)胞株中證實(shí)ERCC1和ERCC2 m

3、RNA水平與順鉑敏感性的關(guān)系，及探討ERCC2 mRNA表達(dá)與紫杉醇敏感性的相關(guān)性。為臨床篩選敏感個(gè)體和敏感藥物，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化化療提供資料。 方法： 第一部分 1.培養(yǎng)國(guó)內(nèi)常用食管鱗癌細(xì)胞株6株。RT-PCR法測(cè)定各細(xì)胞株ERCC1、ERCC2 mRNA表達(dá)及其表達(dá)相關(guān)性。 2.MTT法測(cè)定濃度梯度的順鉑、紫杉醇作用24h后的IC50值(抑制率50％時(shí)的藥物濃度)。比較兩因子mRNA水平與順鉑、紫杉醇IC5

4、0值的相關(guān)性。 第二部分 1.應(yīng)用體外合成靶向ERCC2的siRNA(si-ERCC2)，脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ERCC2高表達(dá)細(xì)胞株KYSE150。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照、脂質(zhì)體對(duì)照和空白對(duì)照組。RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分別檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞ERCC2 mRNA和蛋白水平的表達(dá)。 2.MTT法檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞濃度梯度順鉑和紫杉醇的抑制率，計(jì)算IC50值。比較轉(zhuǎn)染前后順鉑和紫杉醇IC50值的變化。 結(jié)果：

5、 第一部分 1.ERCC1和ERCC2 mRNA表達(dá)情況ERCC1表達(dá)：6株細(xì)胞均可測(cè)出ERCC1特異性條帶，相對(duì)表達(dá)量在0.8214～0.1709間不等。表達(dá)最高的Eca109和最低的TE10表達(dá)量相差4.81倍。ERCC2表達(dá)：TE13未測(cè)出ERCC2條帶，為不表達(dá)ERCC2細(xì)胞株。余5株細(xì)胞可測(cè)出ERCC2表達(dá)。以KYSE150表達(dá)量最高，為0.8712。余4株細(xì)胞表達(dá)量在0.0870～0.2033間不等。與表達(dá)最高的K

6、YSE150表達(dá)量相差4～10倍。ERCC1和ERCC2表達(dá)相關(guān)系數(shù)Rs=0.258，P=0.076>0.05。兩因子表達(dá)存在相關(guān)趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.濃度梯度順鉑和紫杉醇作用24h后各細(xì)胞株IC50值及與ERCC1和ERCC2 mRNA表達(dá)的相關(guān)性順鉑IC50值在15.17±2.11ug/ml到42.84±3.82ug/ml間不等。其中KYSE150最高，TE13最低。兩者相差2.82倍。 紫杉醇IC50值在3.

7、44±1.05ug/ml到12.85±2.17ug/ml間不等。其中KYSE150最高，TE1最低。兩者相差3.74倍。 ERCC1 mRNA水平與順鉑IC50值相關(guān)系數(shù)Rs=0.835，P<0.01。呈明顯正相關(guān)。ERCC1 mRNA表達(dá)水平越高，順鉑IC50值越高，順鉑敏感性越低。 ERCC2 mRNA水平與順鉑IC50值相關(guān)系數(shù)Rs=0.379，P<0.01。呈明顯正相關(guān)。ERCC2 mRNA表達(dá)水平越高，順鉑IC

8、50值越高，順鉑敏感性越低。 ERCC1 mRNA水平與紫杉醇IC50值相關(guān)系數(shù)Rs=0.180，P>0.05。兩者之間無(wú)明顯相關(guān)性。 ERCC2 mRNA水平與紫杉醇IC50值相關(guān)系數(shù)Rs=0.293，P<0.05。呈明顯正相關(guān)。ERCC2 mRNA表達(dá)水平越高，紫杉醇IC50值越高，紫杉醇敏感性越低。 第二部分 1.siRNA轉(zhuǎn)染KYSE150后ERCC2 mRNA及蛋白水平表達(dá)轉(zhuǎn)染后ERCC2 mR

9、NA水平表達(dá)：si-ERCC2組在轉(zhuǎn)染后24、48、72h于相應(yīng)部位均未測(cè)出ERCC2特異性條帶。而三組對(duì)照三個(gè)時(shí)段均可見(jiàn)特異性條帶，表達(dá)量間無(wú)明顯差別(P>0.05)。說(shuō)明si-ERCC2成功封閉了目的基因mRNA水平的表達(dá)。而三組對(duì)照對(duì)目的基因無(wú)干擾作用。 轉(zhuǎn)染后ERCC2蛋白水平表達(dá)：si-ERCC2組轉(zhuǎn)染24、48、72h后ERCC2蛋白表達(dá)量分別為0.688±0.11，0.484±0.09和0.400±0.04。較對(duì)照

10、組分別下調(diào)31.2％，51.6％和60.0％。而三組對(duì)照表達(dá)量無(wú)明顯差別(P>0.05)。表明si-ERCC2成功下調(diào)了目的基因蛋白水平的表達(dá)，而三組對(duì)照對(duì)其無(wú)下調(diào)作用。 2.siRNA轉(zhuǎn)染KYSE150后順鉑和紫杉醇IC50值的變化si-ERCC2組順鉑IC50值為26.41±2.63ug/ml，較對(duì)照組40.32±3.44ug/ml降低34％。紫杉醇IC50值為6.32±0.87ug/ml，較對(duì)照組的12.66±1.69ug

11、/ml降低49％。明顯低于三組對(duì)照(P<0.01)。說(shuō)明下調(diào)ERCC2表達(dá)降低了順鉑和紫杉醇IC50值，增加了兩藥敏感性。 結(jié)論： 1.所測(cè)食管癌細(xì)胞株ERCC1、ERCC2有不同程度表達(dá)。 2.ERCC1和ERCC2 mRNA水平均與順鉑敏感性呈負(fù)相關(guān)，ERCC2 mRNA水平與紫杉醇敏感性呈負(fù)相關(guān)。ERCC1mRNA水平與紫杉醇敏感性無(wú)關(guān)。 3.轉(zhuǎn)染siRNA成功下調(diào)了ERCC2 mRNA和蛋白水平的