瘤內(nèi)注射抑制miR-21的質(zhì)粒促進(jìn)敲低stat3的DC疫苗的抗腫瘤活性.pdf

1、目的:樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DC)是專職抗原提呈細(xì)胞，可有效誘導(dǎo)初始T細(xì)胞(Naive T cell)活化，促進(jìn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)和輔助性T細(xì)胞(T help cells，Th)的分化。因此，越來(lái)越多的研究者正試圖利用DC疫苗來(lái)治療包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病。隨著對(duì)DC疫苗研究的深入，發(fā)現(xiàn)腫瘤DC疫苗的免疫效應(yīng)受到腫瘤微環(huán)境的限制。腫瘤細(xì)胞通過(guò)釋放IL-10、I

2、L-6、VEGF及M-CSF等細(xì)胞因子，上調(diào)DC的stat3磷酸化水平，抑制DC疫苗的活性。MiR-21是一種在多種腫瘤細(xì)胞中高水平表達(dá)的miRNAs，通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞stat3/IL-6、TGF-β等多個(gè)靶基因的調(diào)控，參與腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)。
　　本研究首先制備敲低stat3的腫瘤DC疫苗，利用乳腺癌荷瘤小鼠模型，觀察抑制腫瘤miR-21并聯(lián)合敲低stat3的DC疫苗的抗腫瘤作用，為臨床DC疫苗的制備及應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　

3、方法:
　　1.制備敲低stat3的DC疫苗
　　(1)制備小鼠來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞(BMDCs):常規(guī)制備小鼠骨髓細(xì)胞，用mGM-CSF和mIL-4誘導(dǎo)DC細(xì)胞分化。
　　(2)攜帶敲低stat3基因的慢病毒包裝并感染DC細(xì)胞:體外培養(yǎng)293T細(xì)胞株，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行慢病毒包裝。用新鮮的病毒液感染體外培養(yǎng)第4天的DC細(xì)胞。
　　(3)腫瘤抗原負(fù)載DC細(xì)胞并誘導(dǎo)其成熟:用X射線照射過(guò)的4T1細(xì)胞裂解液（含50μg

4、/ml的蛋白）負(fù)載培養(yǎng)至第6d的DC細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)12h。然后換成含LPS+IFN-γ的培養(yǎng)基誘導(dǎo)36h，使DC細(xì)胞成熟，至此得到了敲低stat3基因的腫瘤DC疫苗。
　　2.驗(yàn)證DC疫苗中stat3的表達(dá)情況:分別提取敲低stat3的DC疫苗總RNA和總蛋白，通過(guò)real-time PCR和western blot方法，檢測(cè)DC疫苗中stat3的表達(dá)。
　　3.敲低stat3基因的DC疫苗活性檢測(cè)
　　(1)流式細(xì)胞

5、術(shù)檢測(cè)敲低stat3的DC表面分子ICAM-1、CD86和MHC-Ⅱ的表達(dá)。收集敲低stat3的DC，分別加入APC標(biāo)記的抗小鼠CD11c和PE標(biāo)記的抗小鼠CD86、MHCⅡ及ICAM-1抗體，流式細(xì)胞儀分析CD11c+細(xì)胞的表面標(biāo)記MHCⅡ、ICAM-1及CD86的表達(dá)情況。
　　(2)敲低stat3的DC培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的水平:收集DC細(xì)胞培養(yǎng)上清，用ELISA法測(cè)定培養(yǎng)上清中IL-12p40/p70的含量。
　　4.

6、抑制腫瘤miR-21表達(dá)聯(lián)合敲低stat3的DC疫苗的抗腫瘤活性觀察
　　(1)建立小鼠乳腺癌荷瘤模型:將4T1細(xì)胞經(jīng)皮下接種給雌性、7-8周balb/C小鼠（6只/組）。待腫瘤塊體積達(dá)到200 mm3，瘤旁注射攜帶抑制miR-21的質(zhì)粒（100μg/只），3d后再注射一次。末次注射后第3天，瘤旁注射敲低stat3的DC疫苗（106/只），一周后再注射一次DC疫苗。
　　(2)觀察腫瘤生長(zhǎng):接瘤后每天觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，并每隔

7、3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤塊的直徑，按公式（長(zhǎng)徑×短徑2）/2計(jì)算腫瘤塊的體積(mm3)，并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。
　　(3)抑制腫瘤miR-21表達(dá)聯(lián)合敲低stat3的DC疫苗對(duì)乳腺癌荷瘤小鼠脾臟淋巴細(xì)胞功能影響末次DC疫苗免疫后的第7天，處死荷瘤小鼠，流式細(xì)胞儀分析產(chǎn)生IFN-γ的CD8+T細(xì)胞頻數(shù)及CD4+CD25+的Treg細(xì)胞頻數(shù);微量LDH法檢測(cè)脾臟細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的溶細(xì)胞活性(CTL)。
　　結(jié)果:
　　1.通

8、過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法，從四個(gè)攜帶抑制stat3表達(dá)的質(zhì)粒中篩選出對(duì)stat3抑制效率最高的質(zhì)粒。
　　2.與對(duì)照組比較，stat3在敲低stat3的DC細(xì)胞中的表達(dá)水平下降（蛋白水平降低70％，mRNA水平下降30％）。
　　3.與對(duì)照組比較，敲低stat3的DC細(xì)胞的ICAM-1、MHCⅡ及CD86的表達(dá)明顯增加，且促進(jìn)IL-12的分泌。
　　4.抑制miR-21聯(lián)合敲低stat3的DC疫苗，可顯著減緩荷瘤鼠腫瘤的生長(zhǎng);

9、提高小鼠脾淋巴細(xì)胞IFN-γ的產(chǎn)生和CTL活性。但對(duì)荷瘤小鼠脾臟Treg細(xì)胞的分布無(wú)明顯影響。
　　結(jié)論:
　　1.通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法獲得了敲低stat3基因的腫瘤DC疫苗;
　　2.敲低stat3增加DC表面MHCⅡ類分子表達(dá)和IL-12分泌;
　　3.抑制腫瘤細(xì)胞的miR-21表達(dá)后，可提高敲低stat3的腫瘤DC疫苗的抑瘤作用;
　　4.抑制腫瘤miR-21聯(lián)合敲低stat3的腫瘤DC疫苗，可提高荷