表達His-tag-ICP47融合基因腺病毒載體的構建及其免疫活性的研究.pdf

1、背景：器官移植是治療終末期器官疾病的重要方法之一，但供源缺乏和排斥反應是困擾器官移植的兩大難題。肝細胞移植(hepatocyte transplantation，HT)最大的優(yōu)點是可以一肝多用，使更多的人得到移植機會，降低等待肝源時的死亡率，因此有可能取代原位肝移植(orthotopic liver tranplantation，OLT)用于終末期肝臟疾病患者，但免疫排斥仍是HT需要解決的一個重要問題。
　　 隨著現(xiàn)代基因工程的

2、發(fā)展，具有免疫逃逸功能的轉(zhuǎn)基因肝細胞成為HT的研究熱點。腺病毒載體能夠?qū)⑼庠椿虬踩咝У剞D(zhuǎn)染入多種細胞，因此被廣泛地應用于基因治療的各個領域，但宿主對基因表達產(chǎn)物的排斥反應嚴重地限制了基因治療的發(fā)展，臨床現(xiàn)有的免疫抑制劑并不總是有效，而且毒副作用大。因此，降低或消除機體對外源基因表達產(chǎn)物及其轉(zhuǎn)染細胞的免疫反應，成為長期基因治療中的研究熱點。
　　 主要組織相容性復合體(major histocompatibility com

3、plex，MHC)抗原呈遞途徑在免疫排斥方面的研究中越來越引起人們的關注，阻斷MHCⅠ-抗原肽復合物的表達，成為誘導免疫耐受的研究熱點。MHCⅠ限制性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)在病毒感染中發(fā)揮著重要作用，干擾感染細胞表面MHCⅠ類分子抗原呈遞途徑來逃避宿主免疫清除的策略被許多病毒所利用。單純皰疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virusⅠ，HSV-1)基因編碼的立即早期感染性細胞

4、蛋白47(infected cell protein47，ICP47)能與抗原多肽競爭抗原加工相關轉(zhuǎn)運子(transporter associated with antigen presentation，TAP)的肽結合位點，有效地降低CTL的識別和殺傷活性，逃逸宿主的免疫清除。
　　 因此，本研究構建了一種表達His-tag-ICP47融合基因的腺病毒載體，并研究其免疫活性，以期能夠為研究機體免疫耐受機制和基因治療提供重要的探

5、索方向。此外，這些研究可能為拓展病毒免疫學領域，探索病毒和宿主免疫系統(tǒng)之間的相互作用提供了新的研究方向，并為臨床疾病的治療和預防拓展了更廣闊的空間。
　　 第一部分、表達His-tag-ICP47融合基因腺病毒載體的構建
　　 目的：構建表達His-tag-ICP47融合基因的重組腺病毒，并且進行擴增和滴度測定，以便用于其免疫活性的實驗研究。
　　 方法：應用AdEasy-1腺病毒表達載體系統(tǒng)構建表達His-ta

6、g-ICP47融合基因的重組腺病毒r-H-ICP47和對照空載重組腺病毒r-Track。His-tag-ICP47融合基因首先克隆到pAdTrack-CMV載體上，用PmeⅠ酶切后與腺病毒骨架載體pAdEasy-1在BJ5183菌內(nèi)同源重組構建重組腺病毒載體pAdEasy-H-ICP47，PacⅠ酶切線性化后，重組腺病毒載體pAdEasy-H-ICP47在293細胞內(nèi)包裝為重組腺病毒r-H-ICP47。以同樣的方法構建對照空載重組腺病毒

7、r-Track。最終，擴增并檢測病毒滴度。
　　 結果：重組腺病毒r-H-ICP47和r-Track構建成功并且具有良好的感染性，可以在293細胞中包裝成病毒顆粒。重組腺病毒r-H-ICP47和r-Track的滴度測定結果分別為3.7×1010efu/mL和4.4×1010efu/mL。
　　 結論：復制缺陷型重組腺病毒r-H-ICP47和r-Track成功構建，病毒滴度高，能夠在細胞內(nèi)有效地轉(zhuǎn)染和表達，能夠滿足下一步免

8、疫活性研究的要求。
　　 第二部分、表達His-tag-ICP47融合基因重組腺病毒的免疫活性研究
　　 目的：觀察表達His-tag-ICP47融合基因重組腺病毒的免疫活性。
　　 方法：
　　 1.重組腺病毒r-H-ICP47或r-Track轉(zhuǎn)染HL-7702肝細胞，測定對HL-7702細胞的轉(zhuǎn)染效率，并用MTT法測定CTL對轉(zhuǎn)染HL-7702細胞的殺傷活性。
　　 2.以健康人外周血單核細胞

9、(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)為來源，體外誘導培養(yǎng)樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)，測定重組腺病毒r-H-ICP47或r-Track對轉(zhuǎn)染DCs的轉(zhuǎn)染效率，并且采用MTT法測定第24h、48h和72h時重組腺病毒r-H-ICP47或r-Track對轉(zhuǎn)染DCs刺激淋巴細胞增殖活性的影響。
　　 3.重組腺病毒r-H-ICP47或r-Track轉(zhuǎn)染淋巴細胞，測

10、定轉(zhuǎn)染效率，并進行雙向混合淋巴細胞反應(Two-way mixed lymphocyte reaction，TWo-Way MLR)，采用ELISA法分別于第2d、第4d和第6d測定各組MLR上清液中白細胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)和穿孔素(perforin，PF)的濃度。
　　 結果：
　　 1.重組腺病毒r-H-ICP47和r-Track均能高效轉(zhuǎn)染HL-7702肝細胞株，感染效率隨著感染復數(shù)(

11、multiplicity of infection，MOI)升高而升高。MOI為100時，重組腺病毒r-H-ICP47和r-Track對HL-7702細胞的轉(zhuǎn)染效率(86.87±3.14％和90.32±2.25％)均明顯高于MOI為50的轉(zhuǎn)染效率(29.52±5.22％和32.12±2.27％)(P<0.05)，而與MOI為200的轉(zhuǎn)染效率(88.53±3.69％和90.64±3.65％)無顯著性差異(P>0.05)。
　　 當

12、MOI為100的重組腺病毒r-H-ICP47或r-Track轉(zhuǎn)染HL-7702肝細胞后，進行CTL殺傷活性實驗，結果顯示，與r-track組和正常對照組相比，r-H-ICP47組能明顯降低CTL對轉(zhuǎn)染HL-7702細胞的殺傷活性(P<0.05)。
　　 2.重組腺病毒r-H-ICP47和r-Track對DCs的感染效率隨著MOI升高而升高，當MOI為100時，重組腺病毒r-H-ICP47和r-Track對DCs的轉(zhuǎn)染效率(86.

13、92±2.76％和84.08±2.62％)均明顯高于MOI為50的轉(zhuǎn)染效率(30.32±3.08％和23.70±3.23％)(P<0.05)，而與MOI為200的轉(zhuǎn)染效率(91.26±2.59％和87.51±2.41％)無顯著性差異(P>0.05)。
　　 MTT檢測結果顯示，與重組腺病毒r-Track組和正常對照組相比，在培養(yǎng)的第48h和第72h，重組腺病毒r-H-ICP47能夠較明顯地降低轉(zhuǎn)染DCs刺激淋巴細胞增殖的能力(P

14、<0.05)，而在第24h時，DCs刺激淋巴細胞的增殖活性在3組之間均無明顯差異(P>0.05)。
　　 3.重組腺病毒r-H-ICP47和r-Track對淋巴細胞的感染效率隨著MOI升高而升高，當MOI為100時，重組腺病毒r-H-ICP47和r-Track對淋巴細胞的轉(zhuǎn)染效率(87.11±3.29％和82.21±4.01％)均明顯高于MOI為50的轉(zhuǎn)染效率(25.54±4.07％和27.67±2.31％)(P<0.05)，而

15、與MOI為200的轉(zhuǎn)染效率(89.75±2.92％和85.99±3.02％)無顯著性差異(P>0.05)。
　　 Two-way MLR分為5組，D-R-ICP47、D-ICP47組、D-R-Track組、D-Track組和正常對照組，分別用MOI為100的重組腺病毒r-H-ICP47或r-Track轉(zhuǎn)染供體(D)或受體(R)的淋巴細胞后進行Two-way MLR培養(yǎng)，采用ELISA法分別在第2d、第4d和第6d檢測MLR上清液

16、中IL-2和PF的濃度。結果顯示在各個時間段D-R-ICP47組IL-2和PF的濃度均明顯低于其余4組(P<0.05)，并且D-ICP47組IL-2和PF的濃度也低于D-R-Track組、D-Track組和正常對照組(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1.表達His-tag-ICP47的重組腺病毒能夠安全、高效地轉(zhuǎn)染HL-7702細胞、DCs和淋巴細胞，并達到理想的表達水平。
　　 2.表達His-tag-I