小鼠骨髓DC 2-DE技術體系建立及其蛋白質表達分析.pdf

1、樹突狀細胞是機體中功能最強的專職抗原遞呈細胞，既能直接激活初始型T淋巴細胞，啟動早期特異性免疫應答；又能誘導免疫耐受，具有強大的激活CTL及CD4+Th細胞的能力，控制著體內免疫反應的過程，在免疫應答中處于中心位置，已成為免疫學及相關學科的研究熱點。 髓系樹突狀細胞分化發(fā)育的各階段具有不同的功能特點。未成熟期樹突狀細胞可由粘附分子選擇素介導進入炎癥組織，并具有極強的抗原內吞和加工處理能力，但其激活初始T細胞的能力較弱。利用DC來

2、增強機體特異性抗腫瘤免疫能力的研究，已成為腫瘤生物治療的重要課題。同時，國內外都已將其作為腫瘤疫苗應用于基因治療，取得了很好的臨床效果。如果將抗原引入未成熟樹突狀細胞，使之發(fā)育為成熟細胞，則在臨床應用上更為理想。 仙臺病毒載體是細胞質型RNA載體，對各種動物細胞有較高的感染效率；在理論上不存在改變細胞核內染色體的危險性，與以往的載體相比具有更高的安全性。仙臺病毒載體作為基因治療、基因疫苗、基因(蛋白質)功能分析及蛋白質生產研究的

3、載體，受到許多學者的青睞。 本課題對小鼠骨髓來源的未成熟樹突狀細胞的蛋白質表達進行了分析，通過雙向電泳和MALDI-TOFMS分析，運用MS-Fit工具進行鑒定；對仙臺病毒載體處理的成熟DC進行比較蛋白質組分析，尋找差異蛋白；對DC所表達的蛋白質在細胞中的生理作用以及它們相互間的作用進行了分析和探討。研究結果如下： 1.以樹突狀細胞、成纖維細胞、黑色素瘤細胞、宮頸癌CasKi細胞、昆蟲細胞Bm5和e21為研究材料，在不同

4、條件下進行2-DE，采用改進的銀染法檢測蛋白斑點，所分離得到的蛋白點能夠滿足進行質譜分析的要求。 2.未成熟DC表達的蛋白質用2-DE進行分離，得到了約660個蛋白點，取其中118個蛋白點進行MALDI-TOFMS分析，獲得了87個蛋白點的PMF圖，經鑒定、分析發(fā)現(xiàn)，其中與未成熟DC免疫調節(jié)功能相關的蛋白質有40個，占45.98％；與大分子代謝相關的有37個，占42.53％。 3.感染SeV后的DC表達蛋白經質譜分析為胞

5、苷脫氫酶、肌動蛋白素、谷胱甘肽S一轉移酶、甲硫氨酸-tRNA甲酰轉移酶、ADP／ATP轉位酶 2、凋亡效應子Caspase-4前體、肌動蛋白、蛋白酶體p42亞基、腺苷酸環(huán)化酶相關蛋白2、磷酸葡萄變位酶3、IL-1受體、熱休克蛋白70．2、葡萄糖調控蛋白前體、70kDa熱休克蛋白8、乙酸輔酶A連接酶2。 4.感染SeV-sfltl和Sev／AF后DC與未成熟DC相比較，未表達的蛋白質經質譜分析為半胱氨酸蛋白酶抑制劑F的前體

6、、前折疊素的亞基2、膠質成熟因子γ、肽脯氨酰順反異構酶(環(huán)孢素A結合蛋白)、鋅指蛋白9。其它蛋白質只是在表達量上有所下調。 5.SeV、SeV／AF、SeV-sfltl分別感染未成熟DC，在感染后1、2、3、5、7天，檢測DC增殖、凋亡、表面標志物的表達情況。結果顯示，SeV、SeV／AF、SeV-sfltl感染后對DC的增殖、凋亡及細胞表面標志物表達的影響沒有統(tǒng)計學差異。 6.對未成熟DC表達的轉錄因子和凋亡因子的生物

7、功能進行了探討。鋅指蛋白是細胞中重要的轉錄因子，在轉錄水平上對蛋白的表達進行調控。凋亡因子Bcl-2和caspase在細胞的凋亡過程中發(fā)揮重要作用。熱休克蛋白在蛋白質的折疊、定位以及細胞應激反應中有著重要作用。 7.仙臺病毒載體對DC蛋白表達的影響表現(xiàn)在兩個方面：蛋白質種類的的減少和表達量的下調。前者主要是因為病毒的復制序列所造成的，后者主要由載體攜帶的目的基因引起。仙臺病毒載體進入DC后，RNA大量復制，結構蛋白合成增加，導致

8、DC細胞質中蛋白質合成減少。去除復制序列后，病毒RNA不能進行復制，只能依靠轉入DC的RNA作為模板進行轉錄和翻譯，因此DC的蛋白表達下調。 總之，本課題建立了適宜各種細胞蛋白質表達分析的技術體系，特別是在蛋白質的分離過程中，用銀染法檢測2-DE后凝膠上的蛋白斑點，這就可以減少樣品用量，對不易獲得的材料也能開展蛋白質組研究。未成熟DC的蛋白質表達分析得到了87個蛋白點，這對于深入理解DC在免疫系統(tǒng)中的作用具有重要意義。仙臺病毒載