融合蛋白(CREKA)-,3--tTF選擇性誘發(fā)腫瘤組織血管栓.pdf

1、利用靶向性血栓藥物對(duì)實(shí)體瘤血管的選擇性栓塞是一種新穎的抗腫瘤策略。該策略以截短的組織因子(truncated Tissue Factor，tTF)為效應(yīng)因子，結(jié)合腫瘤血管靶向載體實(shí)現(xiàn)選擇性誘發(fā)腫瘤組織血管栓塞，阻斷腫瘤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的供給，引發(fā)腫瘤缺血性壞死，達(dá)到抗腫瘤作用。 這種策略需要靶向至腫瘤血管的載體。CREKA五肽能夠特異性結(jié)合腫瘤血管中的凝血血漿蛋白，具有良好的腫瘤血管靶向作用，是一個(gè)理想的載體。我們通過(guò)構(gòu)建CREK

2、A與tTF融合蛋白來(lái)探討這種融合蛋白是否能夠選擇性誘發(fā)腫瘤組織血管栓塞從而達(dá)到抗腫瘤作用。 首先運(yùn)用生物信息學(xué)的方法對(duì)兩者構(gòu)成的融合蛋白進(jìn)行分子模擬，從理論上選定最優(yōu)的融合蛋白構(gòu)建模式。隨后，利用PCR技術(shù)構(gòu)建了含有CREKA和tTF的融合基因，并將其克隆入pET22b(+)中。通過(guò)大腸桿菌表達(dá)(CREKA)3-tTF融合蛋白，并經(jīng)鎳親和層析柱，及梯度透析復(fù)性獲得純的融合蛋白。然后，利用凝血時(shí)間，F(xiàn)X活化和結(jié)合熒光定量測(cè)定等實(shí)驗(yàn)

3、在體外初步探討了該融合蛋白的活性。RBITC熒光標(biāo)記融合蛋白，利用活體成像儀觀察熒光標(biāo)記融合蛋白在S180移植瘤的小鼠模型的分布，組織切片法結(jié)合共聚焦熒光顯微鏡分析融合蛋白的組織定位。用融合蛋白治療S180移植瘤的小鼠模型，組織切片法分析融合蛋白對(duì)腫瘤組織血管的栓塞作用。 依據(jù)分子模型結(jié)果選定CREKA與tTF的組成模式為(CREKA)3-G4S-tTF。PCR技術(shù)構(gòu)建融合基因，測(cè)序驗(yàn)證獲得正確重組載體，并成功表達(dá)于E.coil

4、 BL21。凝血時(shí)間測(cè)定和FX活化實(shí)驗(yàn)證實(shí)融合蛋白具有凝血活性，熒光定量實(shí)驗(yàn)證實(shí)融合蛋白能夠與凝血血漿蛋白結(jié)合?；铙w成像顯示融合蛋白主要分布于腫瘤組織中，組織切片的熒光定位證實(shí)融合蛋白定位于腫瘤組織血管內(nèi)。融合蛋白治療組小鼠的病理組織切片中觀察到腫瘤組織部分血管血栓栓塞，而在其他正常組織上未觀察到血管血栓。在S180移植瘤的小鼠模型治療中，該融合蛋白能夠地抑制S180腫瘤生長(zhǎng)。 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(CREKA)3-tTF融合蛋白是