RNAi沉默食管癌EC9706細(xì)胞DNA聚合酶β表達(dá)的初步研究.pdf

1、背景 腫瘤的發(fā)生發(fā)展是環(huán)境因素與宿主因素相互作用的結(jié)果，細(xì)胞對(duì)致癌物的敏感性和自身突變的修復(fù)能力直接影響細(xì)胞癌變的幾率。DNA聚合酶β(DNApolymeraseβ)是一條39KD的單條肽鏈小分子蛋白質(zhì)，該聚合酶高度保守，結(jié)構(gòu)上可分為兩部分：8KD的氨基末端和31KD的羧基末端。DNA polβ被認(rèn)為主要是在堿基切除修復(fù)(base excision repair,BER)的過程中填補(bǔ)單核苷酸缺口，包括短片段BER和長(zhǎng)片段BER，

2、是目前DNA聚合酶中錯(cuò)配率最高的一種酶，并且在氧化損傷的過程中發(fā)揮重要作用。由于DNA聚合酶β(DNApolβ)在催化堿基時(shí)的高錯(cuò)誤率，故它的表達(dá)水平過低、過高、或突變的形成都可引起遺傳的不穩(wěn)定性，造成突變積累，促使細(xì)胞的癌變。DNA Polβ的高表達(dá)干擾了體內(nèi)多種修復(fù)系統(tǒng)，從而導(dǎo)致DNA突變率和癌癥易感性增加；高表達(dá)的DNA polβ與腫瘤細(xì)胞耐藥性以及基因組不穩(wěn)定性有一定關(guān)系。DNA polβ缺陷會(huì)降低細(xì)胞的DNA堿基切除修復(fù)(BE

3、R)能力，導(dǎo)致對(duì)甲基甲磺酸(MMS)的高敏感性，同時(shí)甲基甲磺酸或氧化劑等均可誘導(dǎo)DNA polβ的表達(dá)。除了在堿基切除修復(fù)中發(fā)揮作用外，DNA polβ還涉及細(xì)胞周期和細(xì)胞分化，可能參與DNA復(fù)制、重組、與基因組穩(wěn)定性的維持、癌細(xì)胞對(duì)某些藥物的耐藥性等有關(guān)。 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是近年來發(fā)現(xiàn)和發(fā)展起來的一門新興的在轉(zhuǎn)錄水平上的基因阻斷技術(shù)，是一種雙鏈RNA(double-stranded RN

4、A,dsRNA)分子在mRNA水平上關(guān)閉相應(yīng)序列基因的表達(dá)或使其沉默的過程，在基因功能研究和基因治療方面已經(jīng)顯示了巨大的應(yīng)用前景。 目的 本研究旨在探討RNA干擾表達(dá)載體(small interference RNA expression vector)對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞中DNA p01p基因的抑制作用，通過腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)了解siRNA表達(dá)載體能否沉默食管癌細(xì)胞DNA polβ基因及沉默效果，為今后提高腫瘤細(xì)胞對(duì)

5、藥物的敏感性提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法 利用Invivogen公司提供的計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)DNA polβcDNA編碼序列(M13140)，從DNA polβ mRNA基因中選擇2段19個(gè)堿基的特異性序列GGAAGTTTGTAGATGAAGG和TATGAGAGCTCATGCCAAG，分別設(shè)計(jì)2對(duì)66nt的寡核苷酸；每對(duì)66nt寡核苷酸退火后形成兩端各帶Bgl Ⅱ和HindⅢ酶切位點(diǎn)的雙鏈；分別將STL1(退火

6、形成的雙鏈DNA片斷siRNApolβ448)、STL2(退火形成的雙鏈DNA片斷siRNApolβ954)用2.0﹪低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收，分別與pGEM-T easy載體連接，得到克隆重組子pGEM-T-STL2和pGEM-T-STLl；用T4連接酶將目的片段pGEM-T-siRNApolβ448和pGEM-T-siRNApolβ954與線性化的表達(dá)載體pSuper．gfp/neo連接；利用PCR擴(kuò)增法篩選鑒定得到重組的siRNA

7、表達(dá)載體pSuper．gfp/neo-siRNApolβ448和pSuper．gfp/neo-siRNApolβ954，并對(duì)其進(jìn)行DNA序列分析。將表達(dá)載體pSuper．gfp/neo-siRNApolβ448和pSuper．gfp/neo-siRNApolβ954以及空白載體pSuper．gfp/neo分別轉(zhuǎn)染入食管癌EC9706細(xì)胞中，用熒光定量PCR方法檢測(cè)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞與轉(zhuǎn)染細(xì)胞中DNA polβmRNA表達(dá)水平的變化；用流式細(xì)胞儀

8、檢測(cè)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞與轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞周期變化；用臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)順鉑、博萊霉素、甲基藍(lán)、雙氧水影響下未轉(zhuǎn)染細(xì)胞與轉(zhuǎn)染細(xì)胞死亡比率的變化。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.遵循siRNA片段的設(shè)計(jì)原則，最終確定DNA polβ448-466位(GGAAGTTTGTAGATGAAGG)和954-972位(CCTTCATCTACAAACTTCC)為靶序列。 2.siRNA 表達(dá)質(zhì)粒載體pSuper．gfp/neo-siRNApolβ448

9、和pSuper．gfp/neo-siRNApolβ954經(jīng)bgl Ⅱ和hindⅢ雙酶切后，酶切產(chǎn)物經(jīng)2﹪瓊脂糖凝膠電泳鑒定出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)先估計(jì)的片斷大小一致。 3．轉(zhuǎn)染后的EC9706細(xì)胞在倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)，經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞。 4．DNA聚合酶β基因的．mRNA表達(dá)水平在轉(zhuǎn)染靶向siRNA的實(shí)驗(yàn)組1(轉(zhuǎn)染pSuper．gfp/neo-siRNApolp448 的 EC97

10、06 細(xì)胞)和實(shí)驗(yàn)組 2(轉(zhuǎn)染 pSuper．gdp/neo-siRNApolp954的EC9706細(xì)胞)中較空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組相比均顯著降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)方面有高度顯著性差異(P<0.01)，實(shí)驗(yàn)組2中mRNA表達(dá)水平較實(shí)驗(yàn)組1顯著降低，在統(tǒng)計(jì)學(xué)方面也存在顯著差異(P<0.05,P=0．37)；空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組中都存在較高水平的polβmRNA表達(dá)，二者在統(tǒng)計(jì)方面無(wú)顯著性差異(P>0.05)； 5．實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2細(xì)

11、胞的S期都與空載體組和空白對(duì)照組有高度顯著性差異(P<0.01)，說明轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的S期比例顯著增加，細(xì)胞增殖率升高。但實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2之間無(wú)差異(P>0.05，)，說明EC9706細(xì)胞DNApolβ表達(dá)水平降低至本研究范圍對(duì)細(xì)胞增殖率沒有太大影響。 6．順鉑加藥組濃度小于60μmol/l時(shí)，四組細(xì)胞死亡率進(jìn)行比較沒有顯著性差異(P>0.05)，隨著藥物濃度逐漸增加，死亡率開始出現(xiàn)高度顯著性差異(P<0.01)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

12、博萊霉素加藥組和甲基藍(lán)加藥組從各自起始濃度開始，四種細(xì)胞死亡比率就存在高度顯著性差異(P<0.01)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雙氧水加藥組藥物濃度小于120μmol/l時(shí)，四組細(xì)胞死亡率進(jìn)行比較沒有顯著性差異(P>0.05)，隨著藥物濃度逐漸增加，死亡率開始出現(xiàn)高度顯著性差異(P<0.01)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．從而為利用RNA干擾提高腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性提供初步實(shí)驗(yàn)證據(jù)。 結(jié)論 1．成功構(gòu)建出 DNA polβ靶向的 siRNA

13、 真核表達(dá)載體 pSuper．gfp/neo-siRNApolβ448和pSuper．gfp/neo-siRNApolβ954，二者轉(zhuǎn)染食管癌EC9706細(xì)胞后能顯著降低細(xì)胞polpmRNA的表達(dá)，說明構(gòu)建的2個(gè)siRNA真核表達(dá)載體對(duì)DNA polβ有高效和特異的沉默作用，且前者作用更強(qiáng)。 2．初步證實(shí)食管癌EC9706細(xì)胞中DNA polβ過低水平表達(dá)不利于維持細(xì)胞的生物學(xué)特性，細(xì)胞增殖率升高，對(duì)藥物敏感性增加；通過RNA干