RNA靶向干擾PIN1基因表達(dá)對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、前言:
　　 喉鱗狀細(xì)胞癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一,過去的10年中,我國喉癌的發(fā)病率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),我國東北是喉癌的高發(fā)地區(qū)。喉癌對(duì)放療及化療均不敏感,手術(shù)是目前治療的主要手段,但手術(shù)會(huì)給患者造成不同程度的損傷。因此實(shí)現(xiàn)對(duì)喉癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷,并在基因水平尋找新的治療手段為當(dāng)前急待解決的問題。目前,喉癌的發(fā)生機(jī)制尚不明確,探索喉癌發(fā)生機(jī)制,將有助于解決喉癌防治的關(guān)鍵問題,因此發(fā)現(xiàn)喉癌發(fā)生相關(guān)基因、探索喉癌發(fā)生機(jī)制已經(jīng)成為喉

2、癌研究的熱點(diǎn)問題。
　　 PIN1是一種高度保守的、特異的肽基脯氨?；?反異構(gòu)酶,能特異性地催化磷酸化的絲氨酸、蘇氨酸脯氨酸基序發(fā)生異構(gòu),由順式變?yōu)榉词?調(diào)節(jié)底物蛋白。研究表明其過表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān),被稱為腫瘤發(fā)生發(fā)展的催化因子。
　　 RNA干擾是轉(zhuǎn)錄后水平封閉或沉默相應(yīng)基因表達(dá)的新基因阻斷技術(shù),近幾年成為基因治療研究的熱點(diǎn)。其原理是小片段RNA利用堿基互補(bǔ)的原理,特異性地結(jié)合癌基因的mRNA并將其降解,干擾其形

3、成蛋白質(zhì)的功能,阻抑癌蛋白的生成。使癌細(xì)胞向成熟方向分化或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞惡性增殖的目的。
　　 喉癌和其它腫瘤一樣,是一種多基因,多步驟,多階段的發(fā)生過程,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,治療困難。是否可以利用RNAi技術(shù)沉默喉癌細(xì)胞中PIN1基因的表達(dá),以達(dá)到阻止或減緩腫瘤細(xì)胞生長的目的尚屬未知領(lǐng)域。本研究旨在探討RNA干擾PIN1基因表達(dá)對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移、及中心體擴(kuò)增等生物學(xué)行為影響,探索有效的治療

4、靶基因、尋找理想的標(biāo)志物,為喉癌的生物學(xué)治療提供新的分子靶點(diǎn)和理論依據(jù)。
　　 材料與方法:
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料:
　　 (1)喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞系,感受態(tài)大腸桿菌JM109。
　　 (2)主要分子生物學(xué)相關(guān)試劑:RPMI1640培養(yǎng)基,胎牛血清,TRIzol,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒,Taq酶,瓊脂糖,反轉(zhuǎn)錄試劑盒,pSilencerTM4.1-CMV質(zhì)粒,Control-shRNA載體,鼠抗γ微管蛋白

5、單克隆抗體,兔抗β-Actin蛋白單克隆抗體,兔抗PIN1蛋白單克隆抗體,辣根酶標(biāo)記山羊抗兔lgG,FITC標(biāo)記山羊抗鼠IgG(γ微管蛋白特異性),QIAGEN質(zhì)粒中量提取試劑盒。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.構(gòu)建PIN1基因的重組載體
　　 2.應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)喉癌組織、Hep-2細(xì)胞和HEK293細(xì)胞中PIN1基因mRNA表達(dá)情況。
　　 3.用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒PIN1-shRNA轉(zhuǎn)染He

6、p-2細(xì)胞,同時(shí)以轉(zhuǎn)染Control-shRNA載體組和未處理組作為對(duì)照。(分別命名為Hep-2/p-shRNA組、Hep-2/p-Con組和Hep-2組)。
　　 4.RT-PCR和WestemBlot檢測(cè)靶向干擾Hep-2細(xì)胞PIN1基因后mRNA和蛋白的表達(dá)水平。
　　 5.PIN1-shRNA轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　 6.應(yīng)用MTT方法檢測(cè)PIN1-shRNA轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞后細(xì)胞的增

7、殖能力的改變。
　　 7.免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后中心體的擴(kuò)增情況。
　　 8.應(yīng)用Transwell檢測(cè)PIN1-ShRNA轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞后細(xì)胞遷移能力的改變。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.成功構(gòu)建PIN1基因的重組載體。
　　 2.RT-PCR結(jié)果顯示,喉癌組織PIN1的mRNA水平明顯高于癌旁組織,Hep-2細(xì)胞中PIN1的mRNA水平明顯高于HEK293細(xì)胞。
　　 3.RT-

8、PCR和Westernblot灰度比半定量檢測(cè)結(jié)果顯示,特異性PIN1-shRNA轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞72h后mRNA和蛋白水平與對(duì)照組相比明顯降低。
　　 4.PIN1shRNA轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞后與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組喉癌Hep-2細(xì)胞的增殖能力和體外侵襲能力顯著降低、細(xì)胞凋亡率增加。
　　 5.中心體異常統(tǒng)計(jì)結(jié)果:Hep-2細(xì)胞系有明顯的中心體擴(kuò)增,經(jīng)統(tǒng)計(jì)中心體數(shù)目變化范圍為1～7個(gè),PIN1-shRNA轉(zhuǎn)染Hep-2

9、細(xì)胞后,有中心體異常的細(xì)胞數(shù)目(即中心體數(shù)目＞2)為0～1%明顯低于對(duì)照組的10～22%(p＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.與癌旁正常組織和HEK293細(xì)胞系相比較,PIN1基因在喉癌組織中以及Hep-2細(xì)胞系中高表達(dá),揭示其可能參與喉癌發(fā)生發(fā)展。
　　 2.喉癌細(xì)胞中中心體擴(kuò)增顯著,可能是喉癌發(fā)生的原因之一。
　　 3.PIN1特異性shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染喉癌Hep-2細(xì)胞可有效干擾PIN1基因