外泌體介導的口蹄疫病毒感染性RNA在細胞間的傳播作用.pdf

1、口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth diseasevirus，F(xiàn)MDV)引起偶蹄動物的一種烈性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)定為必須報告的傳染病，我國規(guī)定為一類動物疫病。持續(xù)性感染問題是FMD研究的熱點和難點，其形成機制至今無確切答案;近期，有研究報道外泌體(exosomes)可以介導病毒或病毒RNA在細胞間傳播。因此，本研究以感染FMDV的PK-15傳代細胞

2、分離exosomes為研究對象，對exosomes介導FMDV RNA轉移現(xiàn)象進行全面、深入的研究，并探討其發(fā)生的分子機制，最終闡明exosomes在FMDV細胞間傳播的生物學功能及作用。
　　1.收取感染FMDV的PK-15細胞上清液，利用ExoQuick-TC for Tissue CultureMedia and Urine分離試劑盒提取exosomes后，進行鑒定并分析其包裹的病毒成分。RT-PCR可檢測到exosomes

3、中存在FMDV RNA，Western blot沒有檢測到FMDV病毒衣殼蛋白;此外我們將所提exosomes進行電鏡觀察和質譜分析，透視電鏡下可觀察到直徑為40-100nm的圓形囊泡;質譜技術分析了PK-15細胞分泌的exosomes蛋白質組成，鑒定了部分exosomes標志性蛋白分子，且未檢測到FMDV蛋白。而后我們將上述提取的exosomes感染正常PK-15細胞，發(fā)現(xiàn)感染exosomes的PK-15出現(xiàn)細胞病變(CPE)。我們對

4、感染exosomes的PK-15細胞進行western blot檢測，可以檢測到FMDV衣殼蛋白，表明exosomes包裹的FMDV感染性RNA能夠在PK-15細胞中完成再次感染。
　　2.如前所述，為了驗證在中和抗體存在下，exosomes能否保護FMDV逃脫中和抗體的中和作用。我們將從感染FMDV的PK-15細胞中分離的exosomes實驗組及相應對照組分別與本實驗室保存的FMDV中和抗體在體外作用1h，觀察細胞病變情況并進行

5、統(tǒng)計學分析，分析測定的病毒基因組含量差異。實驗發(fā)現(xiàn)，中和抗體可以有效阻止FMDV感染PK-15細胞，但是不能有效阻止exosomes介導的FMDV轉移。這個結果表明，exosomes可以保護FMDV逃避部分中和抗體的中和作用。
　　3.選用可以阻斷exosomes分泌的兩種抑制劑(10μm GW4869、5μmspiroepoxide)，我們將PK-15細胞感染FMDV，分別設立空白對照組，1％ DMSO對照組，GW4869組及s

6、piroepoxide組，6h后收取細胞及上清液，使用qReal-time的方法檢測exosomes和胞內FMDV RNA含量水平變化;實驗發(fā)現(xiàn)，exosomes中抑制劑GW4869組及spiroepoxide組與1％ DMSO對照組相比，F(xiàn)MDV RNA水平顯著降低，同時將上述各組提取的exosomes感染正常PK-15細胞分五個時間段收取細胞和上清液，檢測胞內和胞外FMDV RNA含量水平變化，并進行感染滴度(TCID50)的測定。

7、實驗發(fā)現(xiàn)，胞內和胞外抑制劑GW4869組及spiroepoxide組與1％ DMSO對照組相比，F(xiàn)MDV RNA水平在各個時間段均呈不同程度的降低，且exosomes再感染敏感細胞的能力也隨之下降;這些結果表明，exosomes介導的FMDV感染性RNA的轉運與exosomes的合成、分泌呈正相關依賴性降低的方式，進一步佐證了Exosomes介導FMDV感染性RNA的轉運現(xiàn)象;明確了Exosomes介導FMDV感染性RNA在細胞間的傳播