水產(chǎn)養(yǎng)殖動物重要病原菌等溫擴增芯片技術的研究.pdf

1、水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷增大及養(yǎng)殖環(huán)境和養(yǎng)殖水體污染的日益加劇，使得水產(chǎn)動物疾病暴發(fā)日趨頻繁和嚴重。副溶血弧菌(Vibrio parahaemozyticus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)、哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、輪蟲弧菌(Vibrio rotiferian

2、us)、單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）及海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）等9種致病菌廣泛存在于水產(chǎn)品和養(yǎng)殖水體中，對人體健康和水產(chǎn)動物造成了嚴重威脅。因此，需要建立快速有效的方法和手段實現(xiàn)水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中致病菌的早期檢測、養(yǎng)殖環(huán)境的實時監(jiān)控和預警。
　　本論文首先通過環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）聯(lián)合橫

3、向流動試紙條（lateral flow dipstick，LFD），建立了LAMP-LFD技術，能夠在50 min時間內分別完成對單核細胞增生李斯特菌、海豚鏈球菌和創(chuàng)傷弧菌的快速檢測，其靈敏度達到了3.2×101 cfu/mL或0.64 cfu/反應、8.7×101 cfu/mL和3.7×102 cfu/mL或7.4 cfu/反應。參考單核細胞增生李斯特菌、海豚鏈球菌和創(chuàng)傷弧菌確定的LAMP反應體系和反應條件，并結合已公布的副溶血弧菌、

4、溶藻弧菌、鰻弧菌，確定了LAMP反應的統(tǒng)一體系和條件，并據(jù)此篩選出哈維氏弧菌、河流弧菌和輪蟲弧菌的最適引物組合。進而又將 LAMP技術與微流體芯片技術聯(lián)合應用，建立了可同時檢測副溶血弧菌等9種病原菌的環(huán)介導等溫擴增微流體芯片檢測技術。該技術操作簡單，使用200μL的移液器可實現(xiàn)一次性加樣。可特異性檢出9個病原菌，對嗜水氣單胞菌等其他病原菌的檢測為陰性。該方法的檢測靈敏度范圍為0.40-8.91pg/反應，在35min內即可完成對病原菌的