ChIFN-α-ChIL-2嵌合基因的構(gòu)建、融合表達(dá)及生物學(xué)活性研究.pdf

1、雞的病毒性疾病種類多、危害大，當(dāng)前，缺乏高效廣譜的抗病毒藥物可用；為了研究高效、廣譜、無(wú)殘留、無(wú)污染、不產(chǎn)生耐藥性的基因工程抗病毒藥物，解決當(dāng)前獸醫(yī)臨床上無(wú)高效廣譜抗病毒藥物可用的技術(shù)問(wèn)題，本研究進(jìn)行了雞α干擾素/白細(xì)胞介素2嵌合基因的構(gòu)建、融合表達(dá)及生物學(xué)活性研究。 首先設(shè)計(jì)含雙酶切位點(diǎn)的引物采用RT-PCR方法自羅曼雞脾臟總RNA擴(kuò)增、克隆雞白細(xì)胞介素-2(Chicken interleukin-2，ChIL-2)成熟肽基因

2、；采用重疊延伸PCR(splicing by overlap extension-PCR，SOE-PCR)技術(shù)將雞a干擾素(chicken interferon alpha,ChIFN-α)和ChIL-2成熟肽基因序列通過(guò)一基因柔性linker(G4S)3連接，構(gòu)建重組嵌合基因(ChIFN-α-linker-ChIL-2)并克隆入pGEM-T easy克隆載體，篩選ChIFN-α-linker-ChIL-2，ChIL-2陽(yáng)性重組質(zhì)粒并經(jīng)

3、限制性內(nèi)切酶雙切后連接入經(jīng)相同酶切的pQE-30表達(dá)載體中以構(gòu)建重組表達(dá)載體pQE-30/ChIFN-α-linker-ChIL-2、pQE-30/ChIL-2，將以上重組表達(dá)載體及以前已構(gòu)建成功的pQE-30/ChIFN-α轉(zhuǎn)化入E.coli.JM109中并采用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。分別對(duì)表達(dá)的重組ChIFN-α蛋白(rChIFN-α)、重組ChIL-2蛋白(rChIL-2)、重組融合ChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白(rCh

4、IFN-α-linker-ChIL-2)采用尿素變性、復(fù)性液復(fù)性、PBS溶液透析等方法進(jìn)行純化。采用細(xì)胞病變抑制法分別檢測(cè)rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白、單一rChIFN-α蛋白在雞胚成纖維細(xì)胞(Chicken Embryo Fibroblasts，CEF)上抗水泡性口炎病毒(VSV)活性；采用MTT法和ChIL-2 ELISA試驗(yàn)方法分別檢測(cè)rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白中rChIL-2的含量、單-

5、ChIL-2蛋白對(duì)ConA刺激的雞T淋巴細(xì)胞增殖活性及與抗ChIL-2單抗發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的活性。分別測(cè)定rChIFN-a-linker-ChIL-2蛋白在SPF雞胚上對(duì)新城疫強(qiáng)毒株(NDV)和禽流感H9N2株(AIV H9N2)抑制活性以測(cè)定其在雞胚內(nèi)抗病毒活性。分別測(cè)定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白對(duì)NDV活疫苗和滅活疫苗的免疫增強(qiáng)作用以測(cè)定其在雞體內(nèi)的抗病毒活性及ChIL-2蛋白的疫苗免疫增強(qiáng)活性。 結(jié)

6、果表明： 克隆了ChIL-2成熟肽基因，全長(zhǎng)363bp，編碼121個(gè)氨基酸；表達(dá)的rChIL-2蛋白分子量大小約為16.3kD左右；經(jīng)純化后蛋白純度在95％以上。采用SOE-PCR方法成功構(gòu)建了ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因及其pQE-30重組表達(dá)載體(pQE-30/ChIFN-α-linker-ChIL-2)，對(duì)其測(cè)序結(jié)果表明重組表達(dá)質(zhì)粒中插入的ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因全長(zhǎng)909b

7、p，編碼300個(gè)氨基酸，插入方向正確，核苷酸序列無(wú)變異。表達(dá)的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白分子量大小約35.9kD，與預(yù)期大小相一致;蛋白經(jīng)純化后純度在96％以上?；钚匝芯拷Y(jié)果表明：rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在細(xì)胞上具有明顯的抗病毒活性，其在CEF細(xì)胞上的抗VSV活性單位(9.36×107IU/mg)，明顯高于單一rChIFN-α的抗病毒效價(jià)(4.09×105IU/mg)。最低劑量為250pg的

8、rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白可對(duì)Con A活化的雞T淋巴細(xì)胞具有明顯的增殖活性，隨著劑量的增加，rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白對(duì)雞T淋巴細(xì)胞的增殖活性逐漸增強(qiáng)；rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白可以和抗ChIL-2單抗發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，計(jì)算rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白中ChIL-2蛋白的相對(duì)含量約為8.12×10-7mg/mL，說(shuō)明rChIFN-α-linker-

9、ChIL-2蛋白中的ChIL-2蛋白具有免疫學(xué)生物活性。rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在SPF雞胚內(nèi)可明顯減輕NDV強(qiáng)毒株和AIV H9N2毒株所引起的胚體出血，并能顯著延長(zhǎng)雞胚存活時(shí)間，表明rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在雞胚內(nèi)具有明顯的抗病毒活性。rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白對(duì)NDV滅活疫苗具有顯著的免疫增強(qiáng)作用，但對(duì)NDV活疫苗免疫增強(qiáng)作用不明顯，表明rChIFN-α-lin

10、ker-ChIL-2蛋白在雞體內(nèi)既具有抗病毒活性，同時(shí)也具有IL-2的免疫增強(qiáng)作用。以上結(jié)果表明rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在雞體內(nèi)外均具有ChIFN-α和ChIL-2蛋白的雙重生物學(xué)活性。 本研究成功構(gòu)建了ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因，并對(duì)其進(jìn)行了融合表達(dá)和純化；純化后的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在細(xì)胞上和雞體內(nèi)均具有抗病毒活性和ChIL-2蛋白的雙重生物學(xué)活性，