豬LSM14A基因抑制PRRSV復(fù)制及G4基因激活NF-κB的功能研究.pdf

1、1豬LSM14A基因抑制PRRSV復(fù)制的功能研究
　　豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS），又稱豬藍耳病，是一種全球性的病毒性傳染性疾病，主要由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)引起。PRRSV是一種單股正鏈的RNA病毒，主要造成仔豬高死亡率

2、、各年齡階段豬的呼吸道病癥，以及妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等危害，給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的損失。
　　模式識別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）通常包括質(zhì)膜定位的Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)，胞質(zhì)定位的RIG-Ⅰ樣受體（RIG-Ⅰ-like receptors，RLRs）和NOD樣受體(NOD-like receptors，NLRs)等，在先天免疫反應(yīng)中通

3、過識別病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)發(fā)揮著重要的作用。LSM14A作為一種新型胞質(zhì)病毒核酸受體，可以直接識別并結(jié)合病毒核酸，包括RNA和DNA，繼而通過與RIG-Ⅰ或VISA相互作用，介導(dǎo)Ⅰ型干擾素(Interferons，IFNs)的表達。過表達LSM14A可以有效抑制水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitisvirus，VSV)和新城疫病毒(

4、Newcastle Disease virus，NDV)在293細(xì)胞中的復(fù)制，但是過表達LSM14A基因是否對PRRSV復(fù)制產(chǎn)生影響尚未見報道。因此，本研究以新型病毒核酸受體LSM14A作為抗病候選基因，在非洲綠猴腎細(xì)胞(Marc-145cells)和豬肺泡巨噬細(xì)胞（Porcine alveolar macrophages，PAMs）中進行相關(guān)的功能研究，以期解析該基因在PRRSV復(fù)制過程中的作用。得到如下結(jié)果:
　　(1)成功克

5、隆了通城豬LSM14A、IFI6、IFI16、PPBP、ZDHHC9和CLU基因，分別構(gòu)建了真核過表達載體pRK-Flag-LSM14A、pRK-Flag-IFI6、pRK-Flag-IFI16、pRK-Flag-PPBP、pRK-Flag-ZDHHC9和pRK-Flag-CLU，在Marc-145細(xì)胞中通過過表達實驗研究這些基因?qū)RRSV復(fù)制的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達LSM14A基因可以顯著抑制病毒復(fù)制。
　　(2)在Marc-1

6、45細(xì)胞中通過過表達及干擾，采用定量PCR、免疫熒光和空斑實驗發(fā)現(xiàn)LSM14A基因可以抑制PRRSV復(fù)制，并且采用干擾回復(fù)實驗證實了干擾片段的特異性及有效性。同時采用體外重組的方法構(gòu)建了腺病毒Ad5-LSM14A，通過腺病毒感染的方法在PAMs中過表達了LSM14A基因，在PAMs中研究了該過表達基因?qū)?PRRSV復(fù)制的影響，結(jié)合在PAMs中干擾LSM14A基因?qū)嶒炚f明LSM14A在PAMs中可以抑制PRRSV復(fù)制。
　　(3)在

7、Marc-145細(xì)胞中通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)過表達LSM14A基因可以激活I(lǐng)FN-β和ISRE的啟動子活性，PRRSV感染可以協(xié)同LSM14A基因促進IFN-β和ISRE啟動子活性的激活。同時過表達LSM14A基因后，IFN-β和RIG-Ⅰ基因表達量分別被上調(diào)，一些典型的干擾素誘導(dǎo)基因（IFN-stimulated genes，ISGs）包括IFITMs、IFITs和OAS1的表達量也都被顯著的上調(diào)。結(jié)合啟動子的數(shù)據(jù)說明，在Ma

8、rc-145細(xì)胞中過表達LSM14A可以激活I(lǐng)FN-β抗病毒信號通路，從而抑制PRRSV的復(fù)制。
　　(4)在Marc-145細(xì)胞中過表達LSM14A基因后，促炎因子IL-6、TNF-α基因表達被抑制，說明在Marc-145細(xì)胞中，免疫系統(tǒng)通過激活干擾素抗病毒通路同時抑制過度炎癥反應(yīng)，達到抑制病毒復(fù)制的效果。
　　(5)定量PCR檢測了PRRSV感染7天后的通城豬及大白豬PAMs、脾、肺、淋巴細(xì)胞及組織樣中LSM14A基因的

9、相對表達量，發(fā)現(xiàn)通城豬和大白豬感染PRRSV后LSM14A基因的表達被抑制。
　　2 G4基因激活NF-κB的功能研究
　　主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility complex，MHC）又稱白細(xì)胞抗原復(fù)合體(Leukocyte Antigen complex，LA complex)，經(jīng)典的分類方法將MHC分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三個區(qū)，主要參與機體免疫反應(yīng)，與多種疾病存在一定的相關(guān)性。近年研究發(fā)現(xiàn)MH

10、CⅢ區(qū)中靠近端粒的一側(cè)富含涉及炎癥反應(yīng)的基因，例如TNF超家族成員等，因而Gruen和Weissman將這一區(qū)域命名為MHC-Ⅳ區(qū)。MHC-Ⅳ區(qū)G4是其中研究較少的新基因之一，它位于Hsp70與AIF-1、TNF之間，與成纖維細(xì)胞生長因子受體3（Fibroblast growth factor receptor3，F(xiàn)GFR3）存在互作，同時人G4基因在關(guān)節(jié)炎患者單核細(xì)胞中的表達水平顯著低于正常對照組，說明G4與炎癥反應(yīng)有著一定的聯(lián)系。核

11、轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在機體炎癥反應(yīng)進程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用，因此本研究從MHC-Ⅳ區(qū)的新基因和課題組前期G4基因的研究結(jié)果出發(fā)，探索G4基因在NF-κB信號通路中扮演的角色，并從細(xì)胞和個體水平分析G4蛋白的定位特征，繼而進一步解析G4基因與炎癥反應(yīng)的關(guān)系。得到了如下結(jié)果:
　　(1) G4是MHC-Ⅳ中激活NF-κB的一個重要基因。本研究從MHC-Ⅳ中篩選了7個功能尚不清楚基因，包括ABHD16A、G4(C6orf47)、C6o

12、rf48、GPANK1、MCCD1、SAPCD1和ZBTB12，研究這些基因是否參與NF-κB信號通路的激活，結(jié)果顯示這7個新基因中僅G4可以顯著激活NF-κB，其他基因不參與NF-κB信號通路的激活。同時我們又從蛋白水平做了驗證，共轉(zhuǎn)染G4與p65后免疫熒光結(jié)果顯示p65蛋白由細(xì)胞質(zhì)進入細(xì)胞核，提示此時NF-κB信號通路被激活，進入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。
　　(2)在BHK21細(xì)胞中進行的免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)G4蛋白過表達后有細(xì)胞

13、膜定位趨勢，并且和早期內(nèi)涵體存在部分共定位。利用小鼠組織樣進行的免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)內(nèi)源G4蛋白主要分布于膀胱和肺上皮細(xì)胞，同時內(nèi)源性G4蛋白在小鼠膀胱上皮細(xì)胞中存在細(xì)胞質(zhì)膜分布的現(xiàn)象，但是沒有發(fā)現(xiàn)G4蛋白在大腦、小腦、小腸及肝臟中存在分布。
　　(3) G4基因激活NF-κB依賴IκB激酶復(fù)合物(Nuclear factor kappa-B kinase，IKK)復(fù)合物而非轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1(TGF-beta-activate

14、dkinase1，TAK1)復(fù)合物。IKK復(fù)合物處于NF-κB信號通路的中下游，IKK復(fù)合物抑制劑PS1145可以顯著抑制過表達G4基因?qū)F-κB信號通路，表明G4基因激活NF-κB信號通路的位置在IKK復(fù)合物的上游;TAK1復(fù)合物處于NF-κB信號通路的上游，TAK1復(fù)合物抑制劑5Z-7-oxozeaenol、TAK1顯性失活突變體TAK1(K63 W)，都不能影響G4基因激活NF-κB信號通路的能力，表明G4基因激活NF-κB信號