基于ABCG2及EGFR表達(dá)的肺癌細(xì)胞系中SP細(xì)胞的藥物敏感性的初步研究.pdf

1、一.研究背景與目的： 目前由于有計(jì)劃、合理地綜合應(yīng)用現(xiàn)有的幾種治療手段，肺癌的5年生存率有所提高，但仍有大部分病人死于局部復(fù)發(fā)或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。令人困惑的是這些情況又是手術(shù)、放療及化療等傳統(tǒng)治療所不能有效解決的。近年來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中存在一群數(shù)量少，但具有自我更新以及多向分化等一系列正常干細(xì)胞特征的細(xì)胞，且這類細(xì)胞具有很強(qiáng)致瘤性，這群細(xì)胞被命名為腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells or tumor stem cells

2、，CSCs or TSCs)。從體外小鼠模型上得到啟示，這類細(xì)胞有可能為腫瘤復(fù)發(fā)、分化及轉(zhuǎn)移的重要原因[7]。 SP細(xì)胞(side population cell，SP cell，側(cè)群細(xì)胞)是利用DNA熒光染料Hoechst33342和流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)的特殊細(xì)胞亞群，它們也具有自我更新、多向分化能力等一系列干細(xì)胞的生物學(xué)特征。目前已有報(bào)道在人體除造血系統(tǒng)外的多種正常組織和一些實(shí)體腫瘤中分離得到SP細(xì)胞，初步闡明了SP細(xì)胞的一系

3、列生物學(xué)特征。但是迄今為止對(duì)人類肺癌中SP細(xì)胞的相關(guān)研究仍處于起步階段。 隨著對(duì)腫瘤干細(xì)胞研究的不斷深入，在不同腫瘤細(xì)胞系以及原代組織標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞的報(bào)道越來越多，但由于缺乏明確而統(tǒng)一的特異性細(xì)胞分型標(biāo)記，在實(shí)體瘤干細(xì)胞的分離鑒定方面卻存在著很大的困難。而利用SP細(xì)胞分離技術(shù)，研究腫瘤細(xì)胞中SP細(xì)胞的相關(guān)特性，將有助于人們了解真正的實(shí)體腫瘤干細(xì)胞，為腫瘤治療提供新的指引。 二.研究方法： 將生長狀態(tài)良好的肺癌

4、細(xì)胞株經(jīng)DNA熒光染料Hoechst—33342染色后進(jìn)行流式細(xì)胞儀無菌分選，分別收集熒光陽性的Non—SP(non side population cell，Non—SP cell，非側(cè)群細(xì)胞)細(xì)胞和熒光陰性的SP細(xì)胞。收集分選后培養(yǎng)一段時(shí)間的細(xì)胞，經(jīng)過ABCG2抗體標(biāo)記后上流式細(xì)胞儀分析，驗(yàn)證SP及Non—SP細(xì)胞表面ABCG2抗原表達(dá)。同時(shí)利用流式細(xì)胞儀測定SP及Non—SP細(xì)胞表面EGFR家族各成員蛋白表達(dá)。經(jīng)過以上方法后，我們

5、以MTT方法檢測臨床上常用的化療藥及靶向藥物對(duì)SP細(xì)胞及Non—SP細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。觀察它們的反應(yīng)性差別，以期為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。 三.結(jié)果： 肺癌細(xì)胞株Glc—82中熒光陰性的SP細(xì)胞比例為14.5％，其他均為Hoechst33342熒光陽性的Non—SP細(xì)胞。對(duì)照組經(jīng)過Verapamil處理后發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞降低到3.6％。收集分選后培養(yǎng)一段時(shí)間的細(xì)胞，經(jīng)過ABCG2抗體標(biāo)記后上流式細(xì)胞儀分析，發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞表面ABCG

6、2抗原陽性的細(xì)胞達(dá)到2.5％，而Non—SP細(xì)胞中該抗原陽性的只有0.6％，差異明顯(P<0.05).利用流式細(xì)胞儀測定SP及Non—SP細(xì)胞表面EGFR蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)除c—erbB1表達(dá)在SP細(xì)胞中(1.33％)高于Non—SP細(xì)胞表達(dá)(0.7％)外，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。其他成員cerbB2-4均無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。我們用臨床上常用的化療藥及靶向藥物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分為六組進(jìn)行：以MTT實(shí)驗(yàn)檢測各藥：carboplatin組、c

7、isplatin組、Lapatinib組、vinorelbine組、Paclitaxel組及docetaxel組對(duì)SP細(xì)胞及Non—SP細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。結(jié)果表明，各組化療藥對(duì)SP細(xì)胞的抑制作用均小于Non—SP細(xì)胞，重復(fù)測三次數(shù)值并行配對(duì)T檢驗(yàn)(P<0.002)。同時(shí)采用MTT法重復(fù)三次測每組IC50值(圖2.1.4 G)，并行配對(duì)T檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)。采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 四.結(jié)論： 本論文初

8、步探索利用FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter，F(xiàn)ACS)的技術(shù)，基于ABCG2和EGFR蛋白表達(dá)在中國人肺腺癌細(xì)胞系Glc—82中的特點(diǎn)，研究腫瘤干細(xì)胞樣SP細(xì)胞藥物敏感性及得出以下結(jié)論： 一、中國人肺腺癌細(xì)胞系Glc—82中存在SP細(xì)胞亞群。其表面ABCG2分子高表達(dá)于Non—SP細(xì)胞。 二、中國人肺腺癌細(xì)胞系Glc—82中SP細(xì)胞普遍對(duì)化療藥及EGFR靶向藥物耐藥。