睪丸支持細胞對胚胎干細胞向胰島樣細胞團分化過程中不同分化階段細胞的免疫原性影響.pdf

1、目的:
　　觀察睪丸支持細胞與不同分化階段的胚胎干細胞共培養(yǎng)條件下，胚胎干細胞向胰島素分泌細胞分化的不同階段細胞的MHC分子、FAS-L分子表達的情況，以明確睪丸支持細胞對胚胎干細胞向成熟細胞分化過程中胚胎干細胞免疫原性的影響，力圖尋求一種能降低胚胎干細胞源性成熟細胞的免疫原性、誘導宿主免疫耐受的方法來，為糖尿病細胞移植治療的抗移植排斥策略的制定提供理論和實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.睪丸支持細胞的制備:取一個月的雄

2、性昆明小鼠的睪丸組織，經(jīng)Ⅰ型膠原蛋白和胰蛋白酶消化成細胞懸液，離心收集細胞，接種于含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。經(jīng)低滲處理去除生精細胞后可得到純度接近90％的睪丸支持細胞。睪丸支持細胞形態(tài)、由HE染色和油紅O染色鑒定。
　　2.MEF的制備:取孕13.5d的小鼠的胚胎，去除頭尾、內(nèi)臟和四肢后用PBS清洗，充分剪碎(1-3mm3)后再用0.25％胰酶(Trypsin)-0.02％EDTA溶液分“3-階段”消化成細胞懸液，離心收

3、集細胞，傳代純化后備用。
　　3.ESC的擴增:小鼠胚胎干細胞(ESC)接種于經(jīng)絲裂霉素處理1h后的MEF飼養(yǎng)層上，加入ESC培養(yǎng)液(15％胎牛血清，1000IU/mL白血病抑制因子(LIF)和DMEM高糖培養(yǎng)液），每天換液1次，連續(xù)培養(yǎng)擴增3-4d按1∶3-4比例傳代擴增。
　　4.ESC向IPC分化誘導:采用本實驗室傳統(tǒng)的分階段誘導法。實驗組由睪丸支持細胞與胚胎干細胞分化得到的擬胚體(EB)共培養(yǎng)，然后進行向胰島素分泌細

4、胞分化的定向誘導;對照組不接種睪丸支持細胞。另外設置一組睪丸支持細胞對照組。具體方法見下:
　　4.1擬胚體(embryonic bodies，EB)的形成:將培養(yǎng)4-5d的ESC用0.25％胰酶(Trypsin)-0.02％EDTA消化為單細胞，離心收集細胞，接種于低粘附性的細菌培養(yǎng)皿中，添加含有15％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，懸浮培養(yǎng)4-5d，使ESC自發(fā)分化為EB。
　　4.2 nestin陽性細胞(nestin

5、positive cells，NPC)的形成:收集培養(yǎng)4-5d的EB，轉種于預先用Ⅰ型膠原蛋白包被并接種有不同濃度睪丸支持細胞過的6-孔培養(yǎng)板，先用只含有15％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，待EB貼壁后更換為含N2、纖維連接蛋白和bFGF因子的無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，繼續(xù)誘導培養(yǎng)2-3d可形成上皮細胞、成纖維細胞樣NPC。NPC經(jīng)nestin免疫組化染色鑒定。
　　5.ESC向IPC分化各階段細胞的MHC-Ⅰ、

6、MHC-Ⅱ和FAS-L分子檢測:實驗組（共培養(yǎng)組）、對照組（無支持細胞）的EB、NPC、 IPC分化階段和睪丸支持細胞對照組細胞，分別用MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、Fas-L抗體處理后進行流式細胞儀(FCM)分析，檢測各自分子的表達情況。
　　結果:
　　1.睪丸支持細胞培養(yǎng)24h后，貼壁生長，經(jīng)低滲處理可去除生精細胞，3-4d后，呈多邊形或不規(guī)則形，突起粗大。胞質(zhì)內(nèi)有小顆粒狀物質(zhì)。細胞核大而明顯，位于胞體中央，有多個核仁。經(jīng)H

7、E染色、油紅0染色確認為睪丸支持細胞。培養(yǎng)1周，其純度達到90％以上。
　　2.用13.5d的孕小鼠胚胎制備出的原代MEF，在懸浮狀態(tài)下呈圓形。培養(yǎng)24h后，大部分細胞貼壁，呈上皮細胞或成纖維細胞樣，可混雜有少量其他細胞。傳代純化后的MEF形態(tài)為長梭形纖維細胞樣，不含雜細胞。
　　3.ESC接種24h后可貼壁生長。3-4d形成致密圓形或橢圓形的ESC集落。
　　4.ESC脫離分化抑制因素后，懸浮培養(yǎng)4-5d可自發(fā)分化、

8、增殖，形成團狀的EB。EB在NPC誘導培養(yǎng)基中貼壁生長。繼續(xù)誘導3-4d可形成了上皮樣細胞的NPCs。再在IPC誘導培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)6d后可形成為胰島樣細胞團(ICCs)。
　　5.FCM分別檢測EB、NPC和ICCs的MHC、FasL分子表達，結果顯示，在在沒有睪丸支持細胞的情況下，F(xiàn)as-L分子表達隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸降低;MHC-Ⅰ分子、MHC-Ⅱ分子表達則呈上升趨勢。當與每毫升104、105、106濃度的睪丸支持細胞共培

9、養(yǎng)時，不同分化階段細胞的Fas-L、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子表達均呈逐漸降低趨勢。
　　6.在預先有睪丸支持細胞貼壁生長的基礎上接種EB，貼壁良好，不易脫落，不需要Ⅰ型膠原蛋白處理。
　　結論:
　　1.本實驗采用睪丸支持細胞和EB共培養(yǎng)誘導分化的方法，在18d左右的時間內(nèi)可獲得具有胰島樣結構的IPC，可見睪丸支持細胞不影響其誘導過程
　　2.在沒有睪丸支持細胞共培養(yǎng)的條件下，EB、NPC和ICCs的免疫原性是