蘇云金芽胞桿菌cry1Ac基因與球孢白僵菌CDEP2基因的融合表達(dá)及功能研究.pdf

1、為了構(gòu)建殺蟲毒力高和殺蟲譜廣的蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt)工程菌株，利用本研究室篩選的Bt高毒力菌株Bt4.0718(CCTCC No.200016)中的cry1Ac基因和在球孢白僵菌(Beauveria bassiana)中新發(fā)現(xiàn)的類枯草桿菌蛋白酶CDEP2基因構(gòu)建融合基因和表達(dá)融合蛋白來(lái)提高Bt晶體蛋白的殺蟲毒力。
　　 根據(jù)GenBank上球孢白僵菌類枯草桿菌蛋白酶基因序列設(shè)計(jì)引物

2、，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出本研究室保存的球孢白僵菌中的類枯草桿菌蛋白酶CDEP2基因的cDNA全序列。經(jīng)過(guò)比較后發(fā)現(xiàn)該基因是球孢白僵菌類枯草桿菌蛋白酶基因家族的新成員(GenBank登錄號(hào)：EF195164)。該基因中1137bp的開放閱讀框編碼一個(gè)含379個(gè)氨基酸、分子量為38.8KDa、pI=8.21的蛋白酶前體。將CDEP2基因的cDNA序列連接到融合表達(dá)載體pET28a(+)的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coli

3、)BL21菌株中。將經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)后的重組菌株進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果表達(dá)了42KD的(His)6-CDEP2蛋白。將純化后的CDEP2蛋白來(lái)免疫新西蘭公兔，制備了該蛋白的多克隆抗體。
　　 以本研究室已經(jīng)成功構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pHT-cry1Ac-HwtxⅨ作為靶標(biāo)質(zhì)粒，通過(guò)Red/ET同源重組技術(shù)，將其中的蜘蛛蛋白酶抑制劑基因(HwtxⅨ)重組替換成CDEP2基因，構(gòu)建新的重組質(zhì)粒pHT-cry1Ac-CDEP2。將該

4、重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到Bt無(wú)晶體突變株Cry-B中，構(gòu)建新的重組工程菌株Cry-B-pHT-cry1Ac-CDEP2。SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)證明融合蛋白在重組菌株中得到表達(dá)。對(duì)Cry-B-pHT-cry1Ac-CDEP2菌株和Cry-B-pHT-cry1Ac菌株研究比較發(fā)現(xiàn)，前者形成晶體所需時(shí)間明顯比后者縮短，晶體蛋白表達(dá)量明顯增加。生測(cè)結(jié)果表明Cry-B-pHT-cry1Ac-CDEP2菌株發(fā)酵液對(duì)棉鈴蟲(Helic

5、overpa armigera)三齡幼蟲有高效殺蟲活性，生測(cè)72h后的LC50值為8.50μl/ml，比對(duì)照菌株Cry-B-pHT-cry1Ac降低了49.1％。
　　 本研究首次將殺蟲真菌中的類枯草桿菌蛋白酶CDEP2基因與Btcry1Ac基因融合，并使其在Bt中融合表達(dá)，為拓寬Bt殺蟲譜、提高殺蟲毒力和延緩害蟲對(duì)Bt產(chǎn)生抗性等研究提供了基礎(chǔ)。Red/ET同源重組技術(shù)為Bt cry基因和其它外源毒素基因的融合以及構(gòu)建高毒力的B