輔助生殖技術子代胎盤中生長發(fā)育相關印記基因CDKN1C、PHLDA2及IGF2的表達和基因印記研究.pdf

1、自1978年首例試管嬰兒誕生以來，輔助生殖技術(assisted reproductivetechnology,ART)用于臨床已逾30年，為不孕癥的治療作出了巨大的貢獻。目前，發(fā)達國家1-4％的新生兒來自ART，隨著子代生育高峰的到來，ART子代已逐漸成為世界人口的重要組成部分。ART非自然生殖的特性以及缺乏臨床前安全性研究而直接臨床應用的背景，日益引起人們對其生殖遺傳安全性的關注。雖然目前未發(fā)現(xiàn)ART可直接導致子代出現(xiàn)明顯畸形，但不

2、斷有報道指出，ART子代不良健康風險增加，生長發(fā)育問題就是其中之一，胎兒過度生長或低出生體重兒的風險增高，但原因尚不明確?？赡茉从诓辉蟹驄D自身的遺傳背景，也可能與ART的一系列操作相關。
　　 表觀遺傳學是近年來在國際上迅猛發(fā)展的嶄新研究領域，它是指通過DNA甲基化、組蛋白翻譯后修飾等不改變基因核苷酸序列的方式，將遺傳信息傳遞給子代的過程，包括DNA甲基化、基因組印記、組蛋白修飾等。其中，基因印記使某些基因（印記基因）在個體中只

3、有一個親本來源的等位基因表達。印記基因在人類基因組中只占少數(shù)，但在生長發(fā)育過程中卻發(fā)揮至關重要的作用，一旦出現(xiàn)異常，將導致印記疾病或腫瘤的發(fā)生?；蚪M的印記修飾是可逆的，易受環(huán)境因素的干擾而出現(xiàn)可遺傳的改變，影響子代表型?；蛴∮浽谂渥蛹芭咛グl(fā)育早期需經(jīng)歷擦除及重建過程，ART恰施于這一表觀遺傳修飾重編程的關鍵時期。近年來已有大量研究發(fā)現(xiàn)，ART操作可導致印記基因表達、DNA甲基化修飾等改變。流行病學調查發(fā)現(xiàn)，ART子代患罕見印記異常疾

4、病，如Beckwith-Wiedemann綜合征的風險增加。本課題組之前的研究也發(fā)現(xiàn)，ART子代臍血中印記基因表達、印記狀態(tài)及甲基化狀態(tài)異常。因此，ART極有可能通過干擾基因印記而影響子代生長發(fā)育潛能。
　　 在胚胎期，滋養(yǎng)層細胞較內細胞團對環(huán)境因素的干擾更為敏感，因此胎盤組織發(fā)生表觀遺傳修飾異常的風險比胎兒更大。在胎盤中有許多參與母胎間物質轉運、影響胎盤、胎兒生長的印記基因表達。其中，父源表達（母源印記）的印記基因促進胎兒生長

5、和營養(yǎng)吸收；母源表達（父源印記）的印記基因抑制胎兒生長。這些基因的缺失或異常激活均可導致胎兒生長發(fā)育異常。
　　 ART是否可通過干擾胎盤基因印記而影響子代的生長發(fā)育？其干擾的程度如何？相關機制如何？至今不明。
　　 本研究以人類ART及自然妊娠足月、單胎子代的胎盤組織為研究對象，選擇其中父源印記的生長抑制基因CDKN1C（cyclin-dependent kinase inhibitor1C）、PHLDA2（pleck

6、strin homology-like domain,family A，member2）及母源印記的生長促進基因IGF2(insulin-like growth factor2)，用逆轉錄(reverse transcripTiO2，RT)-實時熒光定量PCR(Real time PCR)、蛋白印跡(Westemblot)、PCR直接測序、RT-PCR直接測序、PCR-聚丙烯酰胺凝膠電泳、亞硫酸鹽測序(bisulfite sequenc

7、ing,BSP)等方法研究其表達、甲基化狀態(tài)及印記狀態(tài)，探索ART影響子代生長發(fā)育的表觀遺傳機制，評估ART的生殖遺傳安全性。
　　 第一部分 ART子代胎盤中印記基因CDKN1C、PHLDA2及IGF2的表達差異
　　 目的：研究ART子代胎盤中生長發(fā)育相關印記基因CDKN1C、PHLDA2及IGF2表達與自然妊娠子代是否存在差異，并探索其與表型間的聯(lián)系。
　　 方法：收集足月、單胎ART子代胎盤39例，自然妊

8、娠子代胎盤40例，比較兩組新生兒出生體重。采用實時熒光定量PCR檢測胎盤中目的基因mRNA表達水平；采用蛋白印跡檢測蛋白表達水平。
　　 結果：ART組新生兒平均出生體重低于對照組，但無顯著性差異。ART組胎盤中，CDKN1C、IGF2 mRNA表達水平均顯著上調，PHLDA2蛋白表達水平顯著上調；PHLDA2 mRNA及CDKN1C、IGF2蛋白表達水平無顯著改變。
　　 結論：ART子代胎盤中存在生長發(fā)育相關印記基因

9、表達異常，可能影響子代的生長發(fā)育潛能。
　　 第二部分 ART子代胎盤中印記基因CDKN1C、PHLDA2及IGF2印記調控區(qū)和啟動子區(qū)的DNA甲基化狀態(tài)研究
　　 目的：研究ART子代胎盤中印記基因CDKN1C、PHLDA2及IGF2印記調控區(qū)及啟動子區(qū)的DNA甲基化狀態(tài)，比較其與自然妊娠子代間的差異，并探索其與基因表達間的關系。
　　 方法：選擇6例ART足月、單胎子代及5例自然妊娠足月、單胎子代胎盤，用亞硫

10、酸鹽測序法檢測目的基因印記調控區(qū) KvDMR1、H19 DMR及CDKN1C、PHLDA2啟動子區(qū)CpG島的DNA甲基化狀態(tài)。
　　 結果：對照組印記調控區(qū)KvDMR1、H19 DMR均呈差異甲基化，甲基化率在50％左右。ART組KvDMR1區(qū)31個CpG位點的甲基化率均低于對照組，第9位點甲基化率顯著下降，其中一例ICSI子代甲基化率明顯低于對照組及其他ART標本；H19 DMR區(qū)20個CpG位點的甲基化率普遍高于對照組，第7

11、位點甲基化率顯著上升，其中一例IVF子代甲基化率明顯高于對照組及其他ART標本。對照組及ART組CDKN1C、PHLDA2啟動子區(qū)均呈低甲基化，甲基化率在0-23％左右。ART組CDKN1C啟動子區(qū)15個CpG位點中，第7-11位點甲基化率顯著下降；PHLDA2啟動子區(qū)23個CpG位點中，第5位點甲基化率顯著下降，第1、2、7、10、11位點甲基化率顯著上升。
　　 結論：ART子代胎盤印記基因的印記調控區(qū)及啟動子區(qū)DNA甲基化

12、狀態(tài)改變，提示ART可能通過干擾調控區(qū)的DNA甲基化而影響印記基因表達。
　　 第三部分 ART子代胎盤中印記基因CDKN1C、PHLDA2及IGF2的印記狀態(tài)研究
　　 目的：研究ART子代胎盤中印記基因CDKN1C、PHLDA2及IGF2的等位基因表達狀態(tài)及CDKN1C、IGF2的親源表達狀態(tài)，揭示它們在胎盤中的印記狀態(tài)是否改變，并探索印記狀態(tài)與印記調控區(qū)DNA甲基化改變及基因表達異常間的關系。
　　 方法：

13、以39例ART足月、單胎子代及40例自然妊娠足月、單胎子代胎盤為研究對象，用PCR-聚丙烯酰胺凝膠電泳、PCR直接測序、RT-PCR直接測序檢測胎盤中目的基因的印記狀態(tài)。
　　 結果：CDKN1C、PHLDA2及IGF2在胎盤中均為單等位基因表達的印記基因。CDKN1C為母源表達、父源印記基因，IGF2為父源表達、母源印記基因。在ART組未發(fā)現(xiàn)上述目的基因異常的印記狀態(tài)。
　　 結論：ART子代胎盤印記調控區(qū)及啟動子區(qū)D