HCV E2蛋白經(jīng)DC-SIGN受體對Raf-MEK1-2信號轉(zhuǎn)導途徑的調(diào)控.pdf

1、病毒受體是位于細胞表面、由宿主細胞基因所編碼、參與病毒感染宿主細胞的分子或分子復合物，決定病毒的宿主細胞特異性、組織嗜性及致病性的主要因素之一。病毒可以與一個或一個以上的細胞表面受體結合，在不同類型細胞可共用相同受體，而同種病毒在不同類型細胞所結合的受體也有可能不同。 目前，對于丙型肝炎病毒(HCV)進入宿主細胞的確切機制仍不十分清楚，但一般認為病毒表面包膜蛋白與其特異性受體的結合是病毒感染細胞的關鍵環(huán)節(jié)。研究人員應用真核細胞表

2、達的HCV主要包膜蛋白E2、E1/E2異二聚體、類病毒顆粒為工具，在體外模擬天然病毒體與靶細胞的相互作用。相繼發(fā)現(xiàn)了人細胞表面CD81、低密度脂蛋白受體(LDLR)、B型清道夫受體Ⅰ(SRBI)、樹突狀細胞特異性細胞粘附分子-3-結合非整合素分子(DC-SIGN)和肝/淋巴細胞特異性細胞間粘附分子-3-結合整合素分子(L-SIGN)等，認為上述分子可作為HCV受體而介導HCV與靶細胞的結合。近期的研究表明，HCV和HCVE2蛋白可以與樹

3、突狀細胞表面的DC-SIGN或肝竇內(nèi)皮細胞表面的L-SIGN結合，該復合物進入早期內(nèi)質(zhì)體以逃避溶酶體對HCV的降解，從而利于其在體內(nèi)播散，并在體內(nèi)較長時間保持感染性，高度提示此與HCV的慢性感染有關。但這些受體如何參與對HCV或HCVE2蛋白的識別、介導結合以及傳遞其刺激至靶細胞內(nèi)信號途徑還不完全清楚。 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉(zhuǎn)導途徑參與對多種細胞功能的調(diào)控。生長因子、細胞因子、應激信號及有絲分裂原等細胞外信號等可通

4、過多種途徑激活MAPK家族成員、介導各類細胞反應，其中Raf-MEK1/2通路主要介導來自生長因子和有絲分裂原等細胞外信號的信號傳遞，與細胞增殖有關。研究揭示，許多病毒可通過調(diào)控MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑而發(fā)揮致病作用。雖然HCV結構及非結構蛋白對細胞信號轉(zhuǎn)導途徑的調(diào)控被認為與其致病機制密切相關，但HCV包膜蛋白在HCV的致病過程中所起的作用仍需做進一步探討。 因HCV與靶細胞表面相應受體的結合為其致病過程的首發(fā)事件，故此可能在HCV

5、致病機制中占極重要的地位。本教研室前期工作，研究CHO細胞表達HCVE2蛋白經(jīng)人CD81和LDLR受體所引發(fā)靶細胞的異常跨膜信號轉(zhuǎn)導與HCV致病性的關聯(lián)。在上述研究的基礎上，本課題側(cè)重研究DC-SIGN在識別、接受并傳遞HCVE2信號到細胞內(nèi)Raf-MEK1/2途徑中的作用。以HCVE2蛋白、DC-SIGN受體、Raf-MEK1/2途徑為研究體系，選擇穩(wěn)定表達DC-SIGN的細胞及瞬時表達DC-SIGN的細胞為研究對象，擬闡明HCVE2

6、蛋白與DC-SIGN的作用特性，探討HCVE2蛋白經(jīng)DC-SIGN受體對Raf-MEK1/2途徑的調(diào)控。 一、HCVE2蛋白經(jīng)DC-SIGN對細胞Raf-MEK1/2途徑的調(diào)控以MLV為載體構建DC-SIGN、L-SIGN的表達質(zhì)粒MX-DC-SIGN、MX-L-SIGN，并用其轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，篩選出穩(wěn)定表達DC-SIGN和L-SIGN的NIH3T3/MX-DC-SIGN和NIH3T3/MX-L-SIGN細胞株。流式細胞術

7、檢測表明，NIH3T3/MX-DC-SIGN和NIH3T3/MX-L-SIGN細胞高表達DC-SIGN(陽性細胞為99.58％)和L-SIGN(陽性細胞為92.39％)，并且均可與HCVE2蛋白以較高比例結合(陽性細胞分別為73.27％和77.79％)。與之相反，親本NIH3T3細胞不表達DC-SIGN和L-SIGN，也不與HCVE2蛋白結合。競爭抑制試驗發(fā)現(xiàn)，DC-SIGN單抗和L-SIGN單抗可抑制HCVE2蛋白與NIH3T3/MX

8、-DC-SIGN和NIH3T3/MX-L-SIGN細胞的結合，該抑制作用與單抗?jié)舛瘸蕜┝恳蕾囮P系。 進一步采用激光共聚焦的方法，研究細胞表面DC-SIGN的表達和HCVE2蛋白的結合情況。結果顯示，NIH3T3/MX-DC-SIGN細胞表面有DC-SIGN的表達(綠色熒光)和HCVE2蛋白的結合(紅色熒光)，黃色熒光則提示DC-SIGN與HCVE2蛋白于細胞膜表面的共定位。同時，親本NIH3T3細胞表面無DC-SIGN的表達和H

9、CVE2蛋白的結合。 Raf-MEK1/2途徑中，c-Raf的活化表現(xiàn)為第338位絲氨酸(Ser338)的磷酸化，MEK1/2的活化則表現(xiàn)為第217位和221位絲氨酸(Ser217/221)的磷酸化，磷酸化反應的強弱反映了激酶的激活程度。為確定HCVE2蛋白刺激Raf、MEK1/2的適宜條件，E2蛋白以不同時間刺激NIH3T3/MX-DC-SIGN細胞，收集各時間段的細胞進行裂解，于細胞裂解液中檢測激酶。免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)，2μg

10、/mlHCVE2蛋白刺激30min可有效激活細胞內(nèi)Raf和MEK1/2，表現(xiàn)為這兩種激酶的磷酸化水平升高，并且各份樣品中非磷酸化的Raf、MEK1/2總量基本一致，從而保證了實驗體系的可比性。進一步研究DC-SIGN在HCVE2蛋白上調(diào)Raf、MEK1/2磷酸化過程中的作用，發(fā)現(xiàn)DC-SIGN單抗、L-SIGN單抗均可減弱HCVE2蛋白對細胞內(nèi)Raf、MEK1/2的激活程度。此外，MEK1/2激酶抑制劑-U0126的預處理也明顯抑制E2

11、蛋白對MEK1/2的激活。與之相反，HCVE2蛋白刺激對NIH3T3細胞內(nèi)Raf、MEK1/2磷酸化反應無明顯影響，并且DC-SIGN單抗、L-SIGN單抗亦無抑制作用。 上述結果表明，CHO細胞表達的HCVE2蛋白與DC-SIGN相互作用；E2蛋白上調(diào)Raf、MEK1/2激酶的磷酸化水平，該磷酸化反應的強度同E2刺激持續(xù)時間有關；E2蛋白可經(jīng)DC-SIGN受體而激活Raf、MEK1/2激酶。 二、DC-SIGN/L-S

12、IGN熒光表達質(zhì)粒的構建及其在真核細胞中的表達PCR擴增DC-SIGN和L-SIGN基因片段，分別亞克隆到pMD18-T載體，BamHⅠ/HindⅢ酶切并回收DC-SIGN和L-SIGN基因片段以及pEGFP-N1綠色熒光表達載體，將DC-SIGN和L-SIGN/BamHⅠ+HindⅢ基因片段分別與pEGFP-N1/BamHⅠ+HindⅢ連接，構建含DC-SIGN或L-SIGN的熒光表達質(zhì)粒pEGFP-N1-DC-SIGN和pEGFP-

13、N1-L-SIGN。將pEGFP-N1-DC-SIGN和pEGFP-N1-L-SIGN分別轉(zhuǎn)染人胚腎293T細胞(HEK293T)和人宮頸癌HeLa細胞，并于6、12、24、48小時動態(tài)觀察熒光變化情況。熒光顯微鏡觀察顯示，轉(zhuǎn)染48小時后，兩種細胞內(nèi)均可見綠色熒光，并且HEK293T細胞內(nèi)熒光強度明顯強于HeLa細胞。同時，經(jīng)免疫印跡分析，pEGFP-N1-DC-SIGN轉(zhuǎn)染的HEK293T和HeLa細胞中均可檢測到DC-SIGN的表達