體內(nèi)Pig-a基因突變檢測(cè)方法研究.pdf

1、隨著新藥不斷上市及對(duì)藥品安全性的日益重視，作為藥物非臨床研究的重要組成部分的遺傳毒性檢測(cè)，其檢測(cè)新技術(shù)和新方法的開(kāi)發(fā)成了當(dāng)務(wù)之急。遺傳毒性研究包括體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)，采用不同的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)藥物的潛在遺傳毒性，從而降低藥物在人體臨床實(shí)驗(yàn)中的風(fēng)險(xiǎn)。
　　遺傳毒性試驗(yàn)中的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)非常重要，尤其體現(xiàn)在后續(xù)實(shí)驗(yàn)策略對(duì)試驗(yàn)方法的選擇上，ICH、OECD關(guān)于遺傳實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)原則對(duì)此有很明確的闡述。同時(shí)，為了體現(xiàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的3R原則，在開(kāi)發(fā)新的

2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法時(shí)盡可能將其結(jié)合在一般毒性實(shí)驗(yàn)中，實(shí)現(xiàn)多終點(diǎn)檢測(cè)，最終達(dá)到減少動(dòng)物使用量的目的。本研究針對(duì)現(xiàn)階段遺傳毒性研究的現(xiàn)狀，建立新的遺傳毒性體內(nèi)檢測(cè)基因突變的快捷方法，以達(dá)到上述目的。
　　本研究為建立 SD大鼠體內(nèi) Pig-a基因突變實(shí)驗(yàn)方法開(kāi)展了相關(guān)基礎(chǔ)研究，并將其應(yīng)用于藥物安全性評(píng)價(jià)中。Pig-a基因是糖化磷脂酰肌醇（Glycosylphosphatidyl inositol，GPI）合成的關(guān)鍵基因，GPI合成障礙會(huì)導(dǎo)致

3、細(xì)胞表面 GPI錨連蛋白（CD59、CD55、CD48等）缺失或缺損，突變表型細(xì)胞發(fā)生率（即 RBCCD59-發(fā)生率）可通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)得到，進(jìn)而得到 Pig-a基因突變率。
　　1.研究目的和方法
　　本研究分包括 Pig-a基因突變實(shí)驗(yàn)方法的建立和Pig-a基因突變實(shí)驗(yàn)方法的應(yīng)用二部分。研究?jī)?nèi)容如下：
　　第一部分：實(shí)驗(yàn)方法的建立和優(yōu)化。1）選用ENU作為陽(yáng)性致突變劑，并與DMBA給藥組進(jìn)行比較分析。確定合適陽(yáng)性

4、劑、給藥劑量（分為低劑量連續(xù)給藥組、高劑量連續(xù)給藥組、大劑量單次給藥組）、最佳檢測(cè)時(shí)間等因素。2）分別選用5周齡和9周齡 SD雄性大鼠進(jìn)行自發(fā)和誘發(fā) Pig-a基因突變實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行背景數(shù)據(jù)收集。從而研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物周齡對(duì)Pig-a基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的影響。3）從樣本重復(fù)性檢測(cè)分析、染色細(xì)胞穩(wěn)定性分析、血樣穩(wěn)定性分析、流式細(xì)胞儀檢測(cè)準(zhǔn)確性分析等方面對(duì)Pig-a基因突變實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證。
　　第二部分：實(shí)驗(yàn)方法的應(yīng)用。1）選用兩種抗腫瘤藥順鉑注

5、射液和鹽酸甲基芐肼進(jìn)行檢測(cè)。2）兩種中藥主要藥理毒理成分馬兜鈴酸 A和雷公藤甲素進(jìn)行檢測(cè)。
　　2.研究結(jié)果
　　1）SD大鼠經(jīng) ENU暴露后，在末次給藥后28天進(jìn)行檢測(cè)，低劑量連續(xù)給藥組、高劑量連續(xù)給藥組、大劑量單次給藥組均得到陽(yáng)性結(jié)果，RBCCD59-發(fā)生率分別為溶媒對(duì)照組的5.1倍、13.9倍和6.7倍。2）SD大鼠經(jīng) DMBA（40mg/kg/day）和ENU（100mg/kg/day）暴露后，在末次給藥后28天進(jìn)行

6、檢測(cè)，RBCCD59-發(fā)生率分別為溶媒對(duì)照組的8.8倍和17.2倍；在末次給藥后56天，分別為溶媒對(duì)照組的25.8倍和37.4倍。3）5周齡和9周齡大鼠經(jīng) ENU（100mg/kg/day）暴露，28后 RBCCD59-發(fā)生率分別為溶媒對(duì)照組的17.2倍和11.5倍。4）SD大鼠給予順鉑注射液(2mg/kg/day和5mg/kg/day)，末次給藥后28天檢測(cè)，未能得到陽(yáng)性結(jié)果；SD大鼠給予鹽酸甲基芐肼(100mg/kg/day)，末次

7、給藥28天后 RBCCD59-發(fā)生率為溶媒對(duì)照組的3.4倍，并存在顯著性差異（P<0.01）。5) SD大鼠給予馬兜鈴酸 A（20mg/kg/day）和雷公藤甲素（0.45mg/kg/day），28天檢測(cè)均未得到陽(yáng)性結(jié)果，延長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間至56天，亦未得到陽(yáng)性結(jié)果。
　　3.結(jié)論
　　1）實(shí)驗(yàn)選用了兩種遺傳毒性檢測(cè)常用的誘變?cè)噭?ENU和DMBA作為陽(yáng)性劑進(jìn)行比較。ENU導(dǎo)致 SD大鼠 Pig-a基因突變發(fā)生率高于 DMBA，在

8、后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中均選擇 ENU作為陽(yáng)性對(duì)照。
　　2）實(shí)驗(yàn)分別在末次給藥后第1、2、4、5和8周進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果在末次給藥后第4周的檢測(cè)值接近峰值，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選擇末次給藥后1、2、4周進(jìn)行檢測(cè)。
　　3）實(shí)驗(yàn)選取5周齡和9周齡的SD大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比較，結(jié)果證實(shí)選用5周齡的大鼠檢測(cè)得到的Pig-a基因突變率高于9周齡 SD大鼠，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選擇5周齡大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)對(duì)正常 SD大鼠進(jìn)行背景值檢測(cè)，正常 SD大

9、鼠的自發(fā)RBCCD59-發(fā)生率為12~95×10-6，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供背景數(shù)據(jù)
　　4）方法學(xué)驗(yàn)證：①在檢測(cè)細(xì)胞數(shù)一定的前提下，樣本中所含的被檢目標(biāo)細(xì)胞數(shù)越多，檢測(cè)差異性越小。②染色細(xì)胞穩(wěn)定性：樣本制備完成后，在暗處的放置時(shí)間不超過(guò)3.5小時(shí)，檢測(cè)結(jié)果不會(huì)出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。③血樣穩(wěn)定性：抗凝血樣放置冰箱不超過(guò)1小時(shí)內(nèi)，同放置時(shí)間為8小時(shí)和24小時(shí)的血樣檢測(cè)結(jié)果相比，8小時(shí)和24小時(shí)的血樣檢測(cè)值升高，抗凝血樣放置時(shí)間將影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確

10、性。④流式細(xì)胞儀檢測(cè)準(zhǔn)確性分析：當(dāng)被檢目標(biāo)細(xì)胞數(shù)在一定的數(shù)量時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)值同期望值之間有很高的一致性。⑤檢測(cè)細(xì)胞數(shù)目：當(dāng)檢測(cè)細(xì)胞數(shù)為100 萬(wàn)時(shí)重復(fù)檢測(cè)結(jié)果存在的差異性最小，在實(shí)驗(yàn)條件允許的情況下，盡可能的選擇檢測(cè)數(shù)量多的細(xì)胞數(shù)。
　　5）方法應(yīng)用：①順鉑注射液：對(duì)順鉑組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行血液涂片觀察，發(fā)現(xiàn)其血細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生很大變化，對(duì)于依靠形狀大小檢測(cè)來(lái)區(qū)分細(xì)胞團(tuán)的流式檢測(cè)方法，對(duì)其檢測(cè)結(jié)果有一定的影響。在已獲得的數(shù)據(jù)中，沒(méi)有發(fā)