骨組織工程中一種轉(zhuǎn)基因生物緩釋體系的構(gòu)建——rhBMP-2和rhVEGF基因修飾ADSCs的可行性研究.pdf

1、背景和目的： 骨組織工程為骨折和骨缺損完全再生修復(fù)提供了有效的解決方案。脂肪源性干細(xì)胞(ADSCs)以其容易獲得、體外擴(kuò)增能力強(qiáng)并能定向誘導(dǎo)分化成骨而成為骨組織工程中理想的種子細(xì)胞。rhBMP-2和rhVEGF能夠有效的誘導(dǎo)刺激ADSCs成骨。但二者半衰期短，在單獨(dú)加入種植有ADSCs的支架材料回植入體內(nèi)后，很快就會(huì)被擴(kuò)散稀釋或酶解失效；而通過(guò)復(fù)合到微膠囊、明膠蛋白、纖維蛋白膠中隨之降解釋放，釋放速度或快或慢不易控制，都難以在新

2、骨形成的全過(guò)程中充分發(fā)揮誘導(dǎo)成骨的作用。因此需要在實(shí)際應(yīng)用中找到一種安全可靠且持續(xù)穩(wěn)定誘導(dǎo)ADSCs成骨的細(xì)胞因子緩釋體系。 本課題擬運(yùn)用基因修飾的方法，把對(duì)骨生成有影響的代表性生長(zhǎng)因子rhBMP-2和rhVEGF的基因轉(zhuǎn)染到ADSCs中，然后從ADSCs生物學(xué)性狀的變化、BMP-2和VEGF基因的表達(dá)情況、以及該轉(zhuǎn)染體系的體內(nèi)成骨效應(yīng)三個(gè)方面來(lái)進(jìn)行觀察。以期為ADSCs作為種子細(xì)胞的骨組織工程建立一個(gè)穩(wěn)定可靠的轉(zhuǎn)基因生物緩釋體

3、系。 方法： 采用改良的酶消化法從6月齡貴州小香豬的腹壁脂肪組織中獲得ADSCs。對(duì)ADSCs進(jìn)行成脂、成骨定向誘導(dǎo)分化，波形蛋白檢測(cè)，擴(kuò)增培養(yǎng)等干細(xì)胞特性鑒定。倒置顯微鏡下連續(xù)觀察傳代培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性。 將通過(guò)轉(zhuǎn)化、篩選、擴(kuò)增培養(yǎng)和抽提獲得的rhBMP-2和rhVEGF純化質(zhì)粒，分別以脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)的方式轉(zhuǎn)染第四代穩(wěn)定生長(zhǎng)的ADSCs。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)進(jìn)行G418篩選，得到的陽(yáng)

4、性克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并傳代。用細(xì)胞消化計(jì)數(shù)法和四唑鹽比色法(MTT)對(duì)rhBMP-2和rhVEGF轉(zhuǎn)染前后相對(duì)應(yīng)生長(zhǎng)代數(shù)的ADSCs生長(zhǎng)增殖情況進(jìn)行比較，計(jì)算倍增時(shí)間，繪制生長(zhǎng)曲線。觀察轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞傳代培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況和形態(tài)學(xué)變化。 以RT-PCR和SABC免疫細(xì)胞化學(xué)法在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平觀察rhBMP-2和rhVEGF基因在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和第4周的表達(dá)情況。 建立小香豬自體前肢尺骨中段1.5cm骨缺損模型，根據(jù)不同的修

5、復(fù)方式將動(dòng)物分三個(gè)實(shí)驗(yàn)組：(A組)轉(zhuǎn)染rhBMP-2和rhVEGF基因的ADSCs與脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料(ACBM)復(fù)合而成的新型組織工程骨植入治療組；(B組)正常的ADSCs復(fù)合ACBM植入治療組；(C組)單純骨缺損未處理組。手術(shù)后第1、2、4、12周以x線以及第4周、12周取病理標(biāo)本進(jìn)行脫鈣骨組織切片染色觀察評(píng)價(jià)其成骨修復(fù)效果。 結(jié)果： 脂肪組織通過(guò)改良酶消化法消化后獲得的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)體外成骨和成脂誘導(dǎo)14天后，Gomor

6、i改良鈣鈷染色、VonKossa染色和油紅O染色結(jié)果均為陽(yáng)性；波形蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果表明其為中胚層來(lái)源；且該細(xì)胞能在體外進(jìn)行大量的擴(kuò)增。由此可證明分離培養(yǎng)的細(xì)胞為ADSCs。 傳代培養(yǎng)的ADSCs于第4～6代時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)趨于穩(wěn)定。細(xì)胞形態(tài)由多角形、圓形和不規(guī)則形，逐漸向成纖維細(xì)胞樣和梭形過(guò)渡。rhBMP-2和rhVEGF轉(zhuǎn)染后ADSCs的群體倍增時(shí)間有所增加，但統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染對(duì)ADSCs的生長(zhǎng)增殖無(wú)明顯影響(P＞0.05)。轉(zhuǎn)

7、染后的細(xì)胞仍可具有擴(kuò)增能力。轉(zhuǎn)染后連續(xù)傳代三代的細(xì)胞中未有明顯的異常表型和增生。 rhBMP-2和rhVEGF轉(zhuǎn)染ADSCs后的RT-PCR和SABC免疫細(xì)胞化學(xué)法結(jié)果均為陽(yáng)性。顯示出rhBMP-2和rhVEGF在轉(zhuǎn)染ADSCs后48小時(shí)和四周時(shí)在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平都可表達(dá)BMP-2和VEGF。 動(dòng)物骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)中，前兩周內(nèi)三組動(dòng)物均未出現(xiàn)明顯的感染；連續(xù)X線觀察和骨切片顯示：A組在術(shù)后第三月已完全修復(fù)，且修復(fù)效果和進(jìn)程

8、明顯優(yōu)于B組，C組缺損則主要由纖維結(jié)締充填，而僅在斷端兩側(cè)附近有少量成骨修復(fù)。 結(jié)論： 改良酶消化法可有效地從脂肪組織獲得具有定向誘導(dǎo)分化的ADSCs。這些ADSCs在體外培養(yǎng)至4～6代時(shí)可獲得較穩(wěn)定狀態(tài)。ADSCs作為宿主細(xì)胞被轉(zhuǎn)染外源性rhBMP-2和rhVEGF基因后未發(fā)生畸變及生長(zhǎng)增殖的明顯改變，轉(zhuǎn)染ADSCs后rhBMP-2及rhVEGF基因可獲得四周內(nèi)穩(wěn)定的表達(dá)。說(shuō)明rhBMP-2和rhVEGF基因修飾的AD