促凋亡蛋白PUMA對小鼠肝細胞凋亡的影響及其分子機制研究.pdf

1、PUMA是2001年發(fā)現(xiàn)的一種促凋亡蛋白，最早發(fā)現(xiàn)于直結腸癌細胞中。該基因可以被p53快速誘導，具有強大的促凋亡的作用，故稱其為puma。它屬于凋亡相關蛋白Bcl-2家族，僅擁有一個BH3結構域，是促凋亡蛋白BH3-only亞族的重要成員。BH3-only亞族通過變構效應調節(jié)Bcl-2家族促凋亡和抗凋亡成員的平衡，在凋亡信號通路中處于中心位置。 既往研究表明PUMA基礎表達量較低，在各種應激刺激(如DNA損傷，缺氧，糖皮質激素刺

2、激及血清撤除等)影響下，可以通過p53依賴和非依賴兩種途徑被誘導表達，發(fā)揮著重要的促凋亡作用。由上述應激因素所誘導的細胞凋亡過程中，PUMA的作用是必需的，也就是說沒有PUMA參與，就不會引發(fā)細胞凋亡。現(xiàn)有研究表明puma是p53的直接靶基因，也是介導p53凋亡通路的主要媒介分子。 在研究人類結直腸癌細胞中PUMA介導的細胞凋亡的分子機制時發(fā)現(xiàn)，PUMA通過其BH3結構域分別和Bcl-2家族多種抗凋亡成員(如Bcl-XL、Bcl

3、-2等)產生廣泛的相互作用，使原本結合于抗凋亡蛋白上的Bax解離并多聚化，進而轉位激活線粒體依賴的內源性凋亡通路，誘導結腸癌細胞凋亡。此外Bax的缺失也會引起細胞凋亡障礙。因此PUMA對Bax的調控可能是一條重要的細胞凋亡通路。 我們的前期工作已經發(fā)現(xiàn)促凋亡基因puma在肝臟再生早期下調了5倍，其下調的意義是什么?是否提示PUMA低表達對肝細胞增殖的發(fā)動有顯著作用?puma基因是否是調控肝臟再生的重要或關鍵靶點?其調控的機制是什

4、么?我們對這些問題非常有興趣，希望通過在體、離體實驗揭示其規(guī)律。本課題通過離體實驗研究PUMA對小鼠肝細胞凋亡的影響及其分子機制，對進一步揭示puma在肝臟再生過程中的作用有重要意義。同時，PUMA腺病毒有作為基因治療藥物的廣闊應用前景(BiomedPharmacother，2007)。運用腺病毒載體進行肝細胞離體實驗研究，有助于初步了解PUMA腺病毒作為在體進行基因治療的載體及其對正常肝細胞毒副作用。 課題研究的內容包括以下三

5、個主要部分： 1．用HEK293lowpassage(LP)細胞包裝制備重組PUMA腺病毒(Ad-puma)和GFP(Ad-GFP)腺病毒及其鑒定。 我們實驗用239LP細胞反復包裝多次制備的PUMA腺病毒存儲液。經Millipore10kDa超濾離心管濃縮富集后得到濃縮病毒液。通過普通PCR、Westernblot檢測證明Ad-PUMA在目的細胞中有效高表達。且Ad-GFP在BNI，CL．2細胞中有效表達綠色熒光蛋白。

6、通過殼蛋白免疫法、GFP熒光法計算Ad-PUMA和Ad-GFP的感染性滴度，所制備的病毒濃縮液Ad．PUMA的滴度為2.0×108ifu/ml；Ad-GFP滴度為2.1×10yifu/ml。為進一步的生物學實驗打下了良好的基礎。 2．過表達PUMA后，對小鼠肝細胞BNLCL．2生物學功能的影響(包括周期和凋亡等生物學功能指標)。 在該部分生物學功能實驗中，以MOI=8的Ad-PUMA和Ad-GFP感染細胞。經流式細胞儀檢

7、測分析ANNEXINⅤ標記的早期凋亡細胞，Ad-PUMA感染組比Ad-GFP對照組早期凋亡細胞高出約10倍；Hoechst33342核染色發(fā)現(xiàn)，BNLCL．2細胞有明顯的細胞凋亡形態(tài)特征，且隨時間點推移凋亡細胞數(shù)明顯增加；同時實驗中我們利用Westernblot還檢測發(fā)現(xiàn)，Puma介導的細胞凋亡效應也與線粒體凋亡通路Caspase級聯(lián)效應有關。G0期同步化后的細胞周期發(fā)現(xiàn)，36小時S期細胞明顯增多。36小時S/G2期細胞比Ad-GFP感

8、染組和陰性對照組高出近4倍。PUMA過表達后可能使細胞從S期發(fā)展為G2期時發(fā)生了停留或阻滯。聯(lián)系先前實驗中puma在過程肝再生中下調，puma基因通過對肝細胞凋亡的調節(jié)和對細胞周期的影響參與到肝再生過程中。 3．PUMA對肝細胞生物學功能影響的分子機制研究。 我們運用免疫共沉淀實驗進一步分析了BCL-2家族成員間在PUMA介導的凋亡中的相互作用。實驗中分別研究PUMA、Bax與Bcl-XL的關系時發(fā)現(xiàn)：在腺病毒介導的PU

9、MA過表達后，運用PUMA、Bax共沉淀抗體均可沉淀出Bcl-XL，即PUMA和Bax均可強烈結合Bcl-XL。而且Bax與Bcl-XL的結合，隨時間點推移減低。在存在爭議的PUMA與Bax的相互作用中，我們發(fā)現(xiàn)無論是HA共沉淀抗體pulldown檢測Bax，還是用Bax共沉淀抗體pulldown檢測PUMA，PUMA都能與Bax結合。因此我們推斷，在BNLCL．2細胞中，PUMA促凋亡的分子機制既可能是通過與Bax競爭性結合Bcl-X