促凋亡蛋白PUMA對(duì)小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響及其分子機(jī)制研究.pdf

1、PUMA是2001年發(fā)現(xiàn)的一種促凋亡蛋白，最早發(fā)現(xiàn)于直結(jié)腸癌細(xì)胞中。該基因可以被p53快速誘導(dǎo)，具有強(qiáng)大的促凋亡的作用，故稱其為puma。它屬于凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族，僅擁有一個(gè)BH3結(jié)構(gòu)域，是促凋亡蛋白BH3-only亞族的重要成員。BH3-only亞族通過變構(gòu)效應(yīng)調(diào)節(jié)Bcl-2家族促凋亡和抗凋亡成員的平衡，在凋亡信號(hào)通路中處于中心位置。 既往研究表明PUMA基礎(chǔ)表達(dá)量較低，在各種應(yīng)激刺激(如DNA損傷，缺氧，糖皮質(zhì)激素刺

2、激及血清撤除等)影響下，可以通過p53依賴和非依賴兩種途徑被誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)揮著重要的促凋亡作用。由上述應(yīng)激因素所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中，PUMA的作用是必需的，也就是說沒有PUMA參與，就不會(huì)引發(fā)細(xì)胞凋亡?，F(xiàn)有研究表明puma是p53的直接靶基因，也是介導(dǎo)p53凋亡通路的主要媒介分子。 在研究人類結(jié)直腸癌細(xì)胞中PUMA介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，PUMA通過其BH3結(jié)構(gòu)域分別和Bcl-2家族多種抗凋亡成員(如Bcl-XL、Bcl

3、-2等)產(chǎn)生廣泛的相互作用，使原本結(jié)合于抗凋亡蛋白上的Bax解離并多聚化，進(jìn)而轉(zhuǎn)位激活線粒體依賴的內(nèi)源性凋亡通路，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。此外Bax的缺失也會(huì)引起細(xì)胞凋亡障礙。因此PUMA對(duì)Bax的調(diào)控可能是一條重要的細(xì)胞凋亡通路。 我們的前期工作已經(jīng)發(fā)現(xiàn)促凋亡基因puma在肝臟再生早期下調(diào)了5倍，其下調(diào)的意義是什么?是否提示PUMA低表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞增殖的發(fā)動(dòng)有顯著作用?puma基因是否是調(diào)控肝臟再生的重要或關(guān)鍵靶點(diǎn)?其調(diào)控的機(jī)制是什

4、么?我們對(duì)這些問題非常有興趣，希望通過在體、離體實(shí)驗(yàn)揭示其規(guī)律。本課題通過離體實(shí)驗(yàn)研究PUMA對(duì)小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響及其分子機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步揭示puma在肝臟再生過程中的作用有重要意義。同時(shí)，PUMA腺病毒有作為基因治療藥物的廣闊應(yīng)用前景(BiomedPharmacother，2007)。運(yùn)用腺病毒載體進(jìn)行肝細(xì)胞離體實(shí)驗(yàn)研究，有助于初步了解PUMA腺病毒作為在體進(jìn)行基因治療的載體及其對(duì)正常肝細(xì)胞毒副作用。 課題研究的內(nèi)容包括以下三

5、個(gè)主要部分： 1．用HEK293lowpassage(LP)細(xì)胞包裝制備重組PUMA腺病毒(Ad-puma)和GFP(Ad-GFP)腺病毒及其鑒定。 我們實(shí)驗(yàn)用239LP細(xì)胞反復(fù)包裝多次制備的PUMA腺病毒存儲(chǔ)液。經(jīng)Millipore10kDa超濾離心管濃縮富集后得到濃縮病毒液。通過普通PCR、Westernblot檢測(cè)證明Ad-PUMA在目的細(xì)胞中有效高表達(dá)。且Ad-GFP在BNI，CL．2細(xì)胞中有效表達(dá)綠色熒光蛋白。

6、通過殼蛋白免疫法、GFP熒光法計(jì)算Ad-PUMA和Ad-GFP的感染性滴度，所制備的病毒濃縮液Ad．PUMA的滴度為2.0×108ifu/ml；Ad-GFP滴度為2.1×10yifu/ml。為進(jìn)一步的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)打下了良好的基礎(chǔ)。 2．過表達(dá)PUMA后，對(duì)小鼠肝細(xì)胞BNLCL．2生物學(xué)功能的影響(包括周期和凋亡等生物學(xué)功能指標(biāo))。 在該部分生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)中，以MOI=8的Ad-PUMA和Ad-GFP感染細(xì)胞。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢

7、測(cè)分析ANNEXINⅤ標(biāo)記的早期凋亡細(xì)胞，Ad-PUMA感染組比Ad-GFP對(duì)照組早期凋亡細(xì)胞高出約10倍；Hoechst33342核染色發(fā)現(xiàn)，BNLCL．2細(xì)胞有明顯的細(xì)胞凋亡形態(tài)特征，且隨時(shí)間點(diǎn)推移凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加；同時(shí)實(shí)驗(yàn)中我們利用Westernblot還檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Puma介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡效應(yīng)也與線粒體凋亡通路Caspase級(jí)聯(lián)效應(yīng)有關(guān)。G0期同步化后的細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，36小時(shí)S期細(xì)胞明顯增多。36小時(shí)S/G2期細(xì)胞比Ad-GFP感

8、染組和陰性對(duì)照組高出近4倍。PUMA過表達(dá)后可能使細(xì)胞從S期發(fā)展為G2期時(shí)發(fā)生了停留或阻滯。聯(lián)系先前實(shí)驗(yàn)中puma在過程肝再生中下調(diào)，puma基因通過對(duì)肝細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)和對(duì)細(xì)胞周期的影響參與到肝再生過程中。 3．PUMA對(duì)肝細(xì)胞生物學(xué)功能影響的分子機(jī)制研究。 我們運(yùn)用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析了BCL-2家族成員間在PUMA介導(dǎo)的凋亡中的相互作用。實(shí)驗(yàn)中分別研究PUMA、Bax與Bcl-XL的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)：在腺病毒介導(dǎo)的PU

9、MA過表達(dá)后，運(yùn)用PUMA、Bax共沉淀抗體均可沉淀出Bcl-XL，即PUMA和Bax均可強(qiáng)烈結(jié)合Bcl-XL。而且Bax與Bcl-XL的結(jié)合，隨時(shí)間點(diǎn)推移減低。在存在爭議的PUMA與Bax的相互作用中，我們發(fā)現(xiàn)無論是HA共沉淀抗體pulldown檢測(cè)Bax，還是用Bax共沉淀抗體pulldown檢測(cè)PUMA，PUMA都能與Bax結(jié)合。因此我們推斷，在BNLCL．2細(xì)胞中，PUMA促凋亡的分子機(jī)制既可能是通過與Bax競爭性結(jié)合Bcl-X