新型口服鬼臼毒素衍生物XWL-1-48抗腫瘤研究及GL331抑制HepG2細(xì)胞生長機(jī)制研究.pdf

1、惡性腫瘤是當(dāng)前危害人類健康的重要疾病之一，藥物化療在腫瘤治療中一直占有重要的地位，其中口服化療給藥方式靈活，同時(shí)可以提高病人的生活質(zhì)量，是一種經(jīng)濟(jì)有效的給藥方式，越來越受到臨床醫(yī)生的青睞。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(Topoisomerase，Topo)是細(xì)胞內(nèi)重要的核酶，也是腫瘤化療的重要靶酶，主要通過催化作用改變DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，在細(xì)胞DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和有絲分裂等重要的生命過程中發(fā)揮著重要作用。鬼臼毒素(podophyllotoxin)是從小

2、蘗科鬼臼屬植物鬼臼的根莖中分離得到的一種木脂素，具有顯著的抗腫瘤活性，但因毒性強(qiáng)、副作用大使其應(yīng)用受到限制，而由鬼臼毒素結(jié)構(gòu)改造所得的衍生物依托泊苷(etoposide，VP-16)和替尼泊苷（teniposide，VM-26）已經(jīng)成為臨床上常用的TopoⅡ抑制劑，它們對小細(xì)胞肺癌、睪丸癌、急性白血病及惡性淋巴瘤等多種癌癥均有良好的療效。但也存在諸如抗癌譜較窄、水溶性差等缺點(diǎn)，還有日益凸現(xiàn)的耐藥問題也限制了它們的應(yīng)用，所以尋找新型鬼臼毒

3、素衍生物一直是重要的研究課題。XWL-1-48是新型的可口服鬼臼毒素衍生物，具有更好的水溶性，易于口服給藥，并具有相對較好的生物利用度，本研究對其的抗腫瘤作用及其相關(guān)機(jī)理進(jìn)行了研究，同時(shí)本文還進(jìn)一步探討了曾進(jìn)入Ⅱ期臨床研究的鬼臼毒素衍生物GL331對HepG2細(xì)胞體外生長的抑制作用及其作用機(jī)制。
　　 本論文分為兩部分，第一部分：新型口服鬼臼毒素衍生物XWL-1-48抗腫瘤作用及機(jī)制研究；第二部分：鬼臼毒素衍生物GL331對He

4、pG2細(xì)胞生長抑制作用及機(jī)制研究。
　　 第一部分新型口服鬼臼毒素衍生物XWL-1-48抗腫瘤作用及其機(jī)制研究
　　 本研究主要探索了新型口服鬼臼毒素衍生物XWL-1-48體內(nèi)、外抗腫瘤作用及其相關(guān)的作用機(jī)理。運(yùn)用TopoⅡα介導(dǎo)的kDNA解連環(huán)實(shí)驗(yàn)顯示，XWL-1-48對TopoⅡα呈現(xiàn)抑制作用并具有一定的劑量依賴性；MTT法檢測結(jié)果顯示XWL-1-48對多株不同組織來源的腫瘤細(xì)胞都具有不同程度的細(xì)胞毒作用，IC50在

5、0.34-2.11μM之間，其中對HepG2和MCF-7細(xì)胞的生長抑制作用更為顯著，并呈現(xiàn)一定的時(shí)間依賴性，其細(xì)胞毒作用強(qiáng)于同系物VP16和GL331，同時(shí)XWL-1-48對親本細(xì)胞KB及其耐藥株KBV均顯示出良好的生長抑制作用，其作用強(qiáng)于GL331和ADR，初步顯示出一定的抗耐藥作用；集落形成實(shí)驗(yàn)表明XWL-1-48能顯著抑制HepG2、MCF-7細(xì)胞的克隆原形成能力，以上這些結(jié)果提示XWL-1-48在體外能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

6、體內(nèi)研究結(jié)果顯示XWL-1-48能夠劑量依賴性地抑制小鼠H22肝癌移植瘤的生長，灌胃給藥高劑量（8mg/kg）組抑瘤率(74.05％)與VP16（26mg/kg）作用基本相當(dāng)(73.95%);HepG2及MCF-7裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)表明：XWL-1-48灌胃給藥對HepG2、MCF-7腫瘤的抑制作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，高劑量組(4mg/kg)移植瘤瘤重抑制率略高于陽性藥組(VP16，23mg/kg)，以上結(jié)果提示XWL-1-48在體內(nèi)也顯

7、示出良好的抗腫瘤效果，并且其抑瘤作用強(qiáng)于VP16，而且XWL-1-48口服給藥之后，小鼠體重雖有下降，但是與VP16相比并無顯著差異，提示XWL-1-48抑瘤作用強(qiáng)于VP16的同時(shí)，并未顯示出更大的毒副作用。研究還顯示：XWL-1-48使HepG2、MCF-7細(xì)胞S期比例升高，說明細(xì)胞發(fā)生S期阻滯；DAPI染色顯示細(xì)胞核皺縮、碎裂、染色加深，提示細(xì)胞發(fā)生了凋亡，且凋亡細(xì)胞隨著XWL-1-48濃度的升高而增加；進(jìn)一步，PI-Annexin

8、 V染色后發(fā)現(xiàn)XWL-1-48劑量依賴性地誘導(dǎo)兩株細(xì)胞發(fā)生凋亡，作用強(qiáng)于同濃度的GL331，這一結(jié)果與抑制細(xì)胞增殖的作用相一致。細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示：XWL-1-48能引起DNA損傷相關(guān)信號(hào)分子,γ-H2AX和p-ATM(Ser1981)表達(dá)增加，提示XWL-1-48能夠引起細(xì)胞內(nèi)DNA損傷，Western blot結(jié)果顯示XWL-1-48能激活DNA損傷相關(guān)的ATM-Chk2-Cdc25A及ATM-p53-p21信號(hào)通路，降低p-Cd

9、k2(Thr160)和Cyclin A的表達(dá)，升高p-Cdk2(Thr14)的表達(dá)，從而降低S期相關(guān)Cyclin A/Cdk2復(fù)合物的活性，引起S期阻滯。運(yùn)用小RNA干擾技術(shù)沉默ATM基因后發(fā)現(xiàn)，XWL-1-48引起的HepG2細(xì)胞S期阻滯有部分恢復(fù)，并且除Cyclin A之外，DNA損傷相關(guān)信號(hào)分子均呈現(xiàn)出相反的變化，這一結(jié)果提示XWL-1-48引起的S期阻滯部分依賴于ATM。進(jìn)一步，XWL-1-48可顯著降低Bcl-2蛋白的表達(dá)，升

10、高Bax/Bcl-2比例及FasL（在HepG2細(xì)胞）或Fas（在MCF-7細(xì)胞）的表達(dá)，活化Caspase-3，這一結(jié)果表明提示XWL-1-48可能啟動(dòng)內(nèi)、外源性凋亡通路而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在HepG2細(xì)胞，運(yùn)用小RNA干擾技術(shù)靶向沉默p53基因后，XWL-1-48引起的S期阻滯及凋亡并無明顯改變，同時(shí)，Western blot結(jié)果顯示p53/p21通路有所恢復(fù)，而其他細(xì)胞周期相關(guān)信號(hào)蛋白及凋亡相關(guān)信號(hào)分子并未出現(xiàn)明顯變化，這些結(jié)果提示，

11、在HepG2細(xì)胞，XWL-1-48引起的細(xì)胞周期阻滯和凋亡作用不依賴于p53。研究還發(fā)現(xiàn)XWL-1-48可降低Mdm2的蛋白表達(dá)水平，減少其進(jìn)入細(xì)胞核，而對Mdm2的基因表達(dá)無顯著影響，而運(yùn)用小RNA沉默p53和ATM基因后，未能恢復(fù)Mdm2的表達(dá)水平，表明XWL-1-48對Mdm2的影響并不依賴于p53和ATM，進(jìn)一步，我們研究發(fā)現(xiàn)XWL-1-48能降低細(xì)胞存活相關(guān)分子p-Akt(Ser473)及p-Mdm2(Ser166)的水平，進(jìn)

12、而增強(qiáng)Mdm2的泛素化水平降低Mdm2蛋白質(zhì)的半衰期，加快了Mdm2蛋白的降解過程，表明對PI3K-Akt-Mdm2存活通路的抑制作用是藥物降低Mdm2水平的原因之一。
　　 綜上所述：XWL-1-48是新型的口服有效的鬼臼毒素衍生物，具有良好的體內(nèi)外抗腫瘤作用，并初步顯示出一定的抗耐藥作用，體內(nèi)試驗(yàn)顯示，其作用強(qiáng)于VP16，且與VP16相比，未顯示出更明顯的毒副作用。XWL-1-48通過對TopoⅡα的抑制作用，引起細(xì)胞內(nèi)DN

13、A損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，并啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)、外源性凋亡通路，同時(shí)抑制細(xì)胞存活通路PI3K-Akt-Mdm2的激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
　　 第二部分鬼臼毒素衍生物GL331對HepG2細(xì)胞生長抑制作用及機(jī)制研究
　　 GL331是半合成的來源于鬼臼毒素的拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑，并進(jìn)入II期臨床研究。本研究觀察GL331對人肝癌HepG2細(xì)胞的生長抑制作用及作用機(jī)制。研究結(jié)果表明GL331可以時(shí)間和濃度依賴性地抑制HepG2

14、細(xì)胞的增殖，并使得HepG2細(xì)胞發(fā)生S期阻滯和凋亡。GL331能夠升高DNA損傷相關(guān)分子γ-H2AX的表達(dá)，使得細(xì)胞內(nèi)ATM、p-ATM(Ser1981)、p-Chk2(Thr68)、p53、p21、p-Cdk2(Thr14)的表達(dá)增加，降低Cdc25A，p-Cdk2（Thr160）和Cyclin A的表達(dá)，說明GL331可引起細(xì)胞內(nèi)DNA損傷，激活DNA損傷信號(hào)通路ATM-p53-p21和ATM-Chk2-Cdc25A從而引起細(xì)胞周期