輔助生殖技術妊娠安全性臨床分析及胎盤蛋白質組學研究.pdf

1、輔助生殖技術應用于臨床30余年，在對各種不育癥治療作出巨大貢獻的同時，也促使了人們對其操作安全性和子代健康的關注。近年來，有研究不斷指出，ART可能會增加子代不良健康風險，包括出生缺陷、出生體重低下、染色體異常、腫瘤及由基因表觀遺傳修飾異常導致的罕見遺傳病發(fā)病等。由于ART各項技術的直接臨床應用均無實驗室的基礎研究背景，所以，ART增加子代不良健康風險的發(fā)生機制并不清楚。ART所涉及的各個環(huán)節(jié)，包括父母的不孕背景和大量非生理性干預，如超

2、促排卵、配子和胚胎體外培養(yǎng)、胚胎移植、胚胎顯微操作等步驟均有可能改變生命早期的發(fā)育，從而影響子代甚至再下一代的健康。面對目前人們對ART子代健康的擔憂以及未來可能潛藏的更多危險，對ART的出生缺陷機制進行檢測和評估已經(jīng)刻不容緩。
　　 目前，多個國家的生殖協(xié)會或ART中心都開始對ART子代進行大型的流行病學調查。但是，大量關于ART安全性的評估，多集中于對新生兒結局的描述，而對妊娠并發(fā)癥的描述較少，且結果不確定。關于ART新生兒

3、不良結局發(fā)生的原因分析更少。相關國內資料尤其缺乏。妊娠并發(fā)癥是妊娠期或分娩過程中出現(xiàn)的病理情況，一方面是異常妊娠過程的臨床表現(xiàn)，另一方面，也是影響母兒健康的關鍵因素。因此，進一步對ART妊娠相關并發(fā)癥的發(fā)生情況和妊娠結局的關系進行分析，有助于ART子代的全面安全性評估，從而更好的分析ART子代不良健康風險增加的可能原因和機制。
　　 胎盤是孕期連接胎兒和母體的重要器官，在妊娠過程中起物質交換和內分泌作用維持胎兒生長并保護胎兒免受

4、外界損傷。胎盤微血管的生成及其網(wǎng)絡構建是母兒物質交換的保證，對于正常妊娠的維持有著十分重要的意義。動物研究發(fā)現(xiàn)胚胎經(jīng)體外培養(yǎng)后常伴有妊娠過程中的胎盤發(fā)育異常，人類ART子代也伴隨胎盤發(fā)育異常幾率增加，但發(fā)生機制不清。因此，對ART子代胎盤功能進行全面的檢測，并對相關分子機制進行研究，有助于進一步評價ART操作對于胎盤發(fā)育和胎兒發(fā)育的影響，并探討其因果關系。
　　 本研究以輔助生殖技術子代為研究對象，首先對ART妊娠并發(fā)癥和妊娠結

5、局進行臨床分析；以臨床發(fā)現(xiàn)ART妊娠和分娩并發(fā)癥及新生兒不良結局發(fā)生率較自然妊娠顯著增加為基礎，應用高通量蛋白質組學研究技術，對ART子代胎盤差異蛋白表達譜進行全面檢測和分析；以實驗發(fā)現(xiàn)ART胎盤存在差異表達蛋白為基礎，選取重點差異蛋白，分析目的蛋白在ART出生體重低下子代胎盤中的表達及相關病理機制，探討ART胎盤發(fā)育與子代低出生體重發(fā)生的關系；總體評價ART技術安全性，分析ART不良妊娠結局發(fā)生的胎盤分子機制，并為臨床改進ART操作、

6、改善ART結局提供理論依據(jù)。
　　 第一部分：輔助生殖技術晚期妊娠并發(fā)癥和妊娠結局臨床分析
　　 目的：評價ART獲得妊娠與自然獲得妊娠相比，是否存在妊娠晚期并發(fā)癥和分娩并發(fā)癥發(fā)生率及新生兒結局的差異；分析新生兒不良結局和ART妊娠并發(fā)癥發(fā)生的關系。
　　 材料與方法：回顧性分析2003-2009年在我院分娩的ART妊娠(包括常規(guī)IVF和ICSI)1013例，以1:3配對、年齡匹配方式隨機抽取同期在我院分娩的自然

7、妊娠3069例作為對照組，比較兩組之間多胎發(fā)生率、妊娠和分娩并發(fā)癥發(fā)生率及新生兒結局是否存在差異。再將兩組分為單胎妊娠和多胎妊娠后，分別統(tǒng)計以上指標是否存在差異。并進一步分析ART新生兒低出生體重和早產與妊娠并發(fā)癥發(fā)生的關系。
　　 結果：ART組多胎發(fā)生率為37.8％，為自然妊娠組的20.9倍。ART組妊娠并發(fā)癥及分娩并發(fā)癥[包括妊娠期高血壓、子癇前期、妊娠期糖尿病( GDM)、妊娠期肝內膽汁淤積癥等( ICP)、前置胎盤、胎

8、盤早剝、足月前胎膜早破(PPROM)、胎盤粘連、產后出血等]和新生兒早產、低出生體重、足月小樣兒、新生兒窒息等發(fā)生率均顯著高于自然妊娠組；相反，巨大兒發(fā)生率顯著低于自然妊娠組。ART單胎妊娠和自然單胎妊娠相比，子癇前期、GDM、前置胎盤、PPROM、臍帶附著異常、胎盤粘連、產后出血及新生兒早產、低出生體重、新生兒窒息等發(fā)生率仍顯著增加。ART多胎妊娠和自然多胎妊娠相比，各妊娠并發(fā)癥和分娩并發(fā)癥發(fā)生率無明顯差異，新生兒足月小樣兒和雙胎發(fā)育

9、不均衡發(fā)生率顯著低于對照組。ART新生兒低出生體重主要由早產引起，而在ART早產友生原因中，合并妊娠并發(fā)癥者占73.2％，其中合并PPROM、ICP、妊娠期高血壓疾病和前置胎盤的比率最高。
　　 結論：ART與妊娠并發(fā)癥、分娩并發(fā)癥發(fā)生率升高和新生兒不良結局相關，其原因與醫(yī)源性的多胎妊娠密切相關。排除多胎因素后，ART單胎妊娠仍存在子癇前期、GDM等并發(fā)癥發(fā)生率增高和新生兒結局不良，提示ART本身也與病理妊娠相關。ART新生兒低

10、出生體重的發(fā)生主要由早產引起，并和妊娠并發(fā)癥，特別是胎盤發(fā)育異常疾病的發(fā)生密切相關。因此，提倡單胚胎移植，嚴格控制ART適應癥，改進臨床ART操作，盡量減少非生理性干預，積極預防和治療妊娠并發(fā)癥有助于改善臨床ART安全性。
　　 第二部分：輔助生殖技術子代胎盤比較蛋白質組學研究
　　 目的：研究ART子代胎盤與自然妊娠子代胎盤相比總蛋白表達譜的改變，探討ART增加子代不良健康風險的胎盤分子機制。
　　 材料與方法

11、：6例常規(guī)IVF-ET妊娠，6例ICSI妊娠和6例同期自然妊娠胎盤提取細胞總蛋白，二維凝膠電泳分離蛋白組成分，銀染染色后應用PDQuest軟件分析數(shù)字化的凝膠圖像，找出ART胎盤組織表達有差異的蛋白質斑點；采用膠內酶解消化方式得到差異蛋白斑點多肽混合物，應用基質輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質譜進行蛋白質鑒定；所有差異蛋白進行生物信息學檢索、歸類和功能分析；選取獲得成功鑒定的代表性差異蛋白進行Western blotting驗證。
　　

12、 結果：1、通過分析二維電泳凝膠圖譜，各胎盤組織檢測到約1200個蛋白質斑點。常規(guī)IVF組和對照組比較，12個蛋白質點表達具有顯著差異，其中7個蛋白質點表達上調，5個蛋白質點表達下調。ICSI組和對照組比較，18個蛋白質點表達具有明顯差異，其中10個蛋白質點表達上調，8個蛋白質點表達下調。其中6個蛋白質點在常規(guī)IVF組和ICSI組中均具有表達改變，且變化趨勢一致。2、通過膠內酶解消化、MALDI TOF-TOF分析得到差異表達蛋白斑點

13、的肽質指紋圖譜，通過MASCOT搜索引擎在NCBI蛋白質數(shù)據(jù)庫中檢索，其中20個蛋白斑點成功獲得鑒定，其中5個蛋白Annexin A3，α-SNAP，hnRNPCl/C2，F(xiàn)TL和ATP5A在常規(guī)IVF組和ICSI組中均有表達差異。3、應用生物信息學方法對蛋白進行歸類和功能分析，差異表達蛋白功能涉及胞膜轉運、代謝、應激反應、細胞骨架和核酸代謝等多個方面。4、應用Western blotting方法對代表性蛋白AnnexinA3，α-SN

14、AP，hnRNP Cl/C2和FTL進行驗證，結果與二維電泳一致。
　　 結論：ART妊娠子代胎盤組織中存在與胞膜轉運、代謝、應激反應、細胞骨架和核酸代謝相關的蛋白質表達變化，提示ART操作可能導致胎盤發(fā)育的異常，而機體也存在相應的保護性措施和代償機制進行糾正。該結果初步篩選了ART相關胎盤差異表達蛋白，為深入探討ART妊娠過程中的胎盤異常發(fā)育機制，進一步明確ART與不良妊娠結局和子代健康之間的關系提供了可靠的資料。
　　

15、 第三部分：Annexin A3和α-SNAP在ART低出生體重子代胎盤中的表達及意義
　　 目的：檢測ART低出生體重子代胎盤中annexin A3和α-SNAP的表達水平，分析其與胎盤微血管生成的關系，并探討annexin A3和α-SNAP表達在ART子代低出生體重發(fā)生中的胎盤分子病理機制。
　　 材料和方法：以12例ART妊娠合并低出生體重(LBW)，12例ART妊娠正常出生體重( NBW)和12例同期自然妊娠

16、子代胎盤為研究對象，采用Westernblotting方法檢測ART/LBW組、ART/NBW組和對照組中annexin A3和α-SNAP表達量的差異。采用免疫組織化學方法進一步檢測annexin A3和α-SNAP在ART/LBW組、ART/NBW組和對照組胎盤組織中的定位和表達差異，用CD34標記代表微血管密度( MVD)方法比較三組間胎盤絨毛微血管分布及密度，并分析胎盤annexin A3和α-SNAP表達與MVD的相關性。

17、r>　　 結果：Western blotting結果顯示，與對照組相比，ART/LBW組胎盤中annexinA3和α-SNAP的表達顯著下降，ART/NBW組annexin A3和α-SNAP的表達顯著上調。免疫組織化學結果顯示annexin A3和α-SNAP在胎盤絨毛滋養(yǎng)細胞，血管內皮細胞及絨毛間質細胞均有表達，表達水平與western blotting結果一致。ART/LBW組胎盤組織中MVD較對照組顯著下降，ART/NBW組M