結(jié)核桿菌抗原CFP21的CTL表位篩選與改造.pdf

1、結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是由結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的一種慢性傳染病,目前仍然是導(dǎo)致傳染病發(fā)病率和死亡率較高的疾病之一。尤其是近年來,由于人體免疫缺陷病毒雙重感染的出現(xiàn)而造成個(gè)體機(jī)會(huì)性感染愈發(fā)嚴(yán)重。目前唯一可用的用于結(jié)核病預(yù)防的疫苗是卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG),但其在預(yù)防成年人患肺結(jié)核的有效性方面受到了限制,并且伴隨著結(jié)核桿菌多重

2、耐藥菌株的出現(xiàn),人們迫切需要研制新型的抗結(jié)核疫苗。
　　 由CD4+輔助性T(Th1)細(xì)胞和CD8+毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)所介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)在抗結(jié)核感染保護(hù)性免疫中發(fā)揮著主導(dǎo)作用。結(jié)核新型疫苗的研究依賴于能被CD8+T細(xì)胞識(shí)別從而產(chǎn)生IFN-γ而發(fā)揮殺傷效應(yīng)的結(jié)核抗原及其相應(yīng)表位的鑒定。分泌蛋白以及細(xì)胞壁蛋白是結(jié)核桿菌主要的免疫保護(hù)抗原,并且位于Mtb基因組和BCG差別區(qū)(RD區(qū))內(nèi)的分泌蛋白由于其在BCG中的缺失,逐漸成為

3、疫苗候選抗原的熱點(diǎn)。優(yōu)勢抗原表位的鑒定,對(duì)發(fā)展更有效的結(jié)核病治療性多表位肽疫苗具有重要的意義,并且能夠?yàn)榛A(chǔ)研究提供理論基礎(chǔ)。
　　 結(jié)核桿菌分泌蛋白CFP21(culture filtrate proteins21,培養(yǎng)濾液蛋白21)位于RD2區(qū),具有高度的免疫原性。CFP21能夠誘導(dǎo)結(jié)核感染結(jié)核患者產(chǎn)生T細(xì)胞增殖反應(yīng)以及釋放高水平IFN-γ,發(fā)揮細(xì)胞殺傷作用,是抗結(jié)核疫苗設(shè)計(jì)的理想候選抗原。
　　 CFP21 HLA

4、-A*0201/03限制性表位的鑒定與改造主要通過以下工作來完成:我們首先運(yùn)用在線數(shù)據(jù)庫,以SYFPEITHI初步預(yù)測,結(jié)合BIMAS和NetCTL1.2在線分析,初步篩選出一系列的天然表位肽。已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,通過對(duì)抗原表位錨定位點(diǎn)的氨基酸替換,能夠增強(qiáng)表位與HLA-Ⅰ分子的結(jié)合力。因此,我們通過將天然表位,按1Y、2L和/或9L進(jìn)行氨基酸置換,獲得改造肽,利用數(shù)據(jù)庫再次分析,以期尋求結(jié)合力更高的表位。綜合分析預(yù)測結(jié)果,選取在至少兩種

5、數(shù)據(jù)庫中評(píng)分結(jié)果位于前10的表位肽,分別是4條母體肽p5(SLVRIVGW)、p13(WATILALV)、p134(AVADHVAAV)、p189(NIMAHVSYV)以及3條改造肽p189-1Y2L9L(YLMAHVSYL)、p134-1Y2L(YLADHVAAV)、p134-1Y2L9L(YLADHVAAL)。對(duì)已經(jīng)篩選出來的表位,我們采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案合成多肽,產(chǎn)物經(jīng)反向高效液相色譜(RP-HPLC)分析、純化,獲得了純度高于9

6、5％的九肽產(chǎn)物。經(jīng)質(zhì)譜測定,分子量所得測定值與理論值相符合。
　　 通過內(nèi)源性抗原提呈途徑中所必需的抗原多肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TAP)缺陷的T2細(xì)胞結(jié)合力以及肽/HLA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),對(duì)初步篩選的表位進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示,相對(duì)于母體肽p134,改造肽p134-1Y2L、p134-1Y2L9L與HLA分子具有更高的結(jié)合力與穩(wěn)定性。通過結(jié)合力及穩(wěn)定性的初步篩選,在7條候選肽中,只有母體肽p134以及相應(yīng)的兩條改造肽,用于后續(xù)ELISPOT以及細(xì)胞

7、毒殺傷作用的T細(xì)胞免疫活性檢測。通過HLA-A*0201+PPD+/HLA-A*03+PPD+健康供者外周血單核細(xì)胞(PBMCs)誘導(dǎo)出能夠分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)的分析以及特異性CTL的LDH殺傷活性檢測顯示,母體肽p134以及兩條改造肽p134-1Y2L和p134-1Y2L9L都能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng),但只有p134誘導(dǎo)出的CTL對(duì)靶細(xì)胞具有明顯的殺傷效應(yīng)。通過上述的工作,我們證明,CFP21134-142(AVADHVAAV),是CFP