DT-AIF-1在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231激活過程中的作用.pdf

1、Daintain/AIF-1(DT/AIF-1)是一個(gè)與炎癥密切相關(guān)的蛋白質(zhì)。前期研究發(fā)現(xiàn)DT/AIF-1在乳腺腫瘤組織中表達(dá)陽性,而在周圍正常組織中為弱陽性或陰性。這提示DT/AIF-1與乳腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)。然而,DT/AIF-1影響乳腺癌進(jìn)程的作用機(jī)理并不清楚。研究發(fā)現(xiàn)DT/AIF-1可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖、遷移以及 T淋巴細(xì)胞的分泌活動(dòng),表明它在巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞的激活過程中發(fā)揮重要的作用?，F(xiàn)在已經(jīng)清楚,巨噬細(xì)胞在腫

2、瘤的發(fā)生以及轉(zhuǎn)移過程中扮演重要角色。由此可見,DT/AIF-1可以通過激活巨噬細(xì)胞來作用于腫瘤的進(jìn)程。然而,DT/AIF-1是否還可以直接影響腫瘤細(xì)胞的行為呢?基于此,本實(shí)驗(yàn)在體外研究了DT/AIF-1對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生理活動(dòng)(包括增殖和分泌活動(dòng))的影響,以期為闡明DT/AIF-1影響乳腺癌進(jìn)程的分子機(jī)制提供幫助。
　　首先,本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了DT/AIF-1在正常乳腺細(xì)胞HBC100以及非轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞 MCF-7和

3、轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231中的表達(dá)。結(jié)果顯示 DT/AIF-1在HBC100中的表達(dá)稍微低于它在MCF-7以及MDA-MB-231中的表達(dá)。
　　其次,為了進(jìn)一步檢測(cè)了DT/AIF-1對(duì)MDA-MB-231增殖以及分泌活動(dòng)的影響。構(gòu)建了兩個(gè)重組質(zhì)粒:pcDNA-DT和pRNAT-DT,它們分別可以促進(jìn)和抑制DT/AIF-1在受體細(xì)胞中的表達(dá)。通過將這兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入MDA-MB-231,分別獲得了DT/AIF-1過表達(dá)和表

4、達(dá)抑制的兩種乳腺癌細(xì)胞。然后,我們觀察了 DT/AIF-1表達(dá)改變對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明DT/AIF-1過表達(dá)MDA-MB-231的增殖速度明顯快于野生型細(xì)胞,而DT/AIF-1表達(dá)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)速度顯著減慢。進(jìn)一步,檢測(cè)了DT/AIF-1對(duì)細(xì)胞周期的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DT/AIF-1表達(dá)被抑制以后,細(xì)胞從G0/G1期向S期以及G2/M期轉(zhuǎn)變的速度明顯慢于對(duì)照細(xì)胞,這說明DT/AIF-1表達(dá)抑制細(xì)胞的細(xì)胞周期延長(zhǎng)了。隨后,檢測(cè)了轉(zhuǎn)染

5、pcDNA-DT和pRNAT-DT以及相應(yīng)空載體pcDNA和 pRNAT的 MDA-MB-231中 G0/G1期細(xì)胞周期調(diào)控蛋白cyclin D1的表達(dá)。結(jié)果表明,DT/AIF-1過表達(dá)可以促進(jìn)cyclin D1的表達(dá),而DT/AIF-1表達(dá)抑制對(duì)cyclin D1表達(dá)的影響剛好相反。緊接著,檢測(cè)了DT/AIF-1對(duì)調(diào)控cyclin D1表達(dá)的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果顯示DT/AIF-1過表達(dá)細(xì)胞中NF-κB的活性明顯高于野生型細(xì)

6、胞和DT/AIF-1表達(dá)抑制細(xì)胞。而且當(dāng)用10％FBS刺激細(xì)胞0.5小時(shí)后,這種差異更加顯著。
　　再有,探索了DT/AIF-1對(duì)細(xì)胞分泌活動(dòng)的影響。結(jié)果表明,培養(yǎng)過pcDNA-DT轉(zhuǎn)染細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子成分多于空質(zhì)粒pcDNA轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞。而且與對(duì)照組條件培養(yǎng)基相比較,這種條件培養(yǎng)基可以促進(jìn)野生型MDA-MB-231增殖。通過LC-MS-MS鑒定,發(fā)現(xiàn)條件培養(yǎng)基中含量增加的一個(gè)成分是14-3-3δ。經(jīng)RT-PCR檢測(cè)發(fā)

7、現(xiàn), pcDNA-DT轉(zhuǎn)染細(xì)胞中14-3-3δ在mRNA水平的表達(dá)明顯高于野生型細(xì)胞和DT/AIF-1表達(dá)抑制細(xì)胞。
　　最后,觀察了DT/AIF-1對(duì)MDA-MB-231在裸鼠皮下形成腫瘤的影響。結(jié)果顯示,皮下接種10周以后,DT/AIF-1過表達(dá)細(xì)胞在所有8個(gè)被接種裸鼠皮下均形成腫瘤,而僅有50%接種空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的裸鼠在皮下形成可見腫瘤。另外, DT/AIF-1過表達(dá)細(xì)胞所形成的腫瘤明顯大于對(duì)照細(xì)胞。通過進(jìn)一步檢測(cè)腫瘤組織中

8、反映細(xì)胞增殖狀況的兩個(gè)指標(biāo)——cyclin D1和Ki67——的表達(dá),結(jié)果顯示,DT/AIF-1過表達(dá)腫瘤組織中cyclin D1和Ki67的表達(dá)明顯多于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照組。
　　上述研究結(jié)果表明:1,DT/AIF-1可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖,這主要與它可以激活NF-κB/cyclin D1信號(hào)通路,從而促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂有關(guān)。2,DT/AIF-1可以增強(qiáng)MDA-MB-231的分泌活動(dòng),而且這種分泌活動(dòng)的增強(qiáng)有利

9、于腫瘤細(xì)胞的增殖。值得注意的是,DT/AIF-1可以促進(jìn)14-3-3δ在MDA-MB-231中的表達(dá)與分泌。由于14-3-3δ是一個(gè)與細(xì)胞的增殖,遷移以及分泌活動(dòng)密切相關(guān)的伴侶分子,因此,上述結(jié)果提示DT/AIF-1對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖以及分泌活動(dòng)的影響很可能與14-3-3δ有關(guān)。3,DT/AIF-1可以促進(jìn)MDA-MB-231在裸鼠皮下形成腫瘤,表明DT/AIF-1是有利于腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的生存以及增殖的。
　　綜上所述,DT/AIF-