伴有t(16;17)(q24;q12)不平衡染色體易位的人急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系SH-2的建立和鑒定.pdf

1、目的:報(bào)道1株伴有t（16；17）（q24；q12）所致衍生16號(hào)染色體為特征的髓系白血病細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特征的初步鑒定。 方法與結(jié)果: 1、病例資料SH—2細(xì)胞系來(lái)自初診時(shí)1例35歲男性AML—M2a患者骨髓，該患者對(duì)多種化療藥物耐藥，于接受異基因半相合外周血造血干細(xì)胞移植后1月余死于白血病復(fù)發(fā)。 2、細(xì)胞系的建立應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液梯度密度離心法常規(guī)分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，以含20%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基調(diào)

2、整細(xì)胞密度為2*106/ml，接種于25c㎡培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4d2/3～半量換液1次，約一周后瓶底出現(xiàn)貼壁黏附的基質(zhì)細(xì)胞，每次換液保留部分貼壁基質(zhì)細(xì)胞與懸浮的白血病細(xì)胞共培養(yǎng)，并調(diào)整細(xì)胞密度為（0.2～1）*106/ml。約一個(gè)月后培養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)緩慢增殖，在培養(yǎng)基中加入細(xì)胞因子10ug/ml的rh—IL—3，3個(gè)月后增殖速度有所增快，4個(gè)月后培養(yǎng)體系中撤去rh—IL—3，每3d繼續(xù)2/3換液1次

3、。目前已在體外培養(yǎng)22月，能耐受凍存和復(fù)蘇，命名為SH—2。 3、SH—2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征及組化染色 SH—2細(xì)胞在瑞氏染色下呈中等大小，大多為圓形和類圓形，胞核圓形，少數(shù)胞核可見(jiàn)輕度凹陷，核染色質(zhì)呈細(xì)致，部分可見(jiàn)核仁，胞漿量中等，染灰藍(lán)色，部分細(xì)胞胞漿中可見(jiàn)少量紫紅色嗜天青顆粒。POX染色58%為陽(yáng)性。α—醋酸萘酚酯酶染色39%為陽(yáng)性，不被氟化鈉抑制。糖原染色18%陽(yáng)性。 4、SH—2細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征

4、 透射電鏡下SH—2細(xì)胞呈圓或橢圓形，細(xì)胞表面有短小微絨毛，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)豐富的細(xì)胞器如：線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、糖原顆粒和溶酶體顆粒，核型不規(guī)則，部分細(xì)胞可見(jiàn)核仁。 5、SH—2細(xì)胞的免疫表型 FCM檢測(cè)顯示SH—2細(xì)胞主要表達(dá)髓系、NK系抗原，也有部分T淋系的標(biāo)志。其中CD13、CD33、CD38、CD117、CD7、CD56、CD25、CD16/56和MPO陽(yáng)性，而T系抗原CD2、CD3、CD4、CD5陰性；B系抗原CD

5、10、CD19、CD20、CD22陰性；單核細(xì)胞系抗原CD14陰性；巨核系CD41、CD61、CD42b陰性；另外CD34、MDR1表達(dá)陰性；嗜堿粒細(xì)胞標(biāo)記CD203陰性。 6、SH—2細(xì)胞的細(xì)胞和分子遺傳學(xué)特征 患者2005年6月23日原代骨髓細(xì)胞核型分析結(jié)果提示45，X，—Y，der（16）t（16；17）（q24；q12），—17，+19[18]。高劑量化療一療程后核型為45，X，—Y，der（16）t（16；17

6、），—17，+19[21]/78，der（16）t（16；17）[1]。2006—2—15（培養(yǎng)5個(gè)多月）細(xì)胞系核型分析結(jié)果為：45，X，—Y，der（16）t（16；17）（q24； q12），—17，+19[5]/45，X，—Y，del（4）（q2？6）、der（16）t（16；17）（q24；q12），—17，+19[2]/69～105，含der（16）t（16；17）×2[15]。培養(yǎng)22個(gè)月SH—2核型分析：染色體數(shù)目分別為7

7、3，75，75，76，76，77，77，78，79，79，81，81，82，85，88，92，94，100，101，102，核型為：73—102（80），XX，—Y，—Y，del（1q31）x2，der（16）t（16；17）（q24； q12）×2，—17，—17，+19，+19[20]。 應(yīng)用16號(hào)和17號(hào)整條染色體涂抹探針進(jìn)行染色體涂抹，結(jié)果顯示：1條16號(hào)和1條17號(hào)染色體分別呈現(xiàn)整條紅色和整條綠色的熒光信號(hào)，提示為正常

8、的16和17號(hào)染色體，1條16號(hào)染色體呈現(xiàn)大的紅色熒光信號(hào)和小的綠色熒光信號(hào)并存，證實(shí)16和17號(hào)染色體之間發(fā)生了不平衡易位，形成衍生16號(hào)染色體同時(shí)丟失了一條17號(hào)染色體。染色體涂抹檢測(cè)19號(hào)染色體三體顯示：分裂相中有3條整條呈綠色熒光信號(hào)的染色體，提示為三體19號(hào)染色體。 FISH檢測(cè)PML/RARα融合基因：所有分析的中期和間期細(xì)胞均顯示分離的雙紅雙綠熒光信號(hào)，未見(jiàn)PML—RARα融合信號(hào)，表明該例的t（16；17）易位

9、未涉及RARα基因。16和17號(hào)染色體斷裂位點(diǎn)定位：（1）FISH檢測(cè)CBFβ基因：在同一條16號(hào)染色體上可見(jiàn)二個(gè)黃色熒光信號(hào)（CBFp）靠近二個(gè)紅色熒光信號(hào)（16號(hào)著絲粒），提示衍生16號(hào)染色體的長(zhǎng)臂斷裂位點(diǎn)位于CBFβ所在的位點(diǎn)16q22以下。（2）FISH檢測(cè)RARα基因：采用16號(hào)著絲粒（紅色信號(hào)）加RARα雙色（紅綠融合信號(hào)），一條染色體顯示紅色熒光信號(hào)提示為正常16號(hào)染色體；1條染色體顯示紅綠融合信號(hào)提示正常的17號(hào)染色體；

10、另1條染色體中間呈紅色信號(hào)而另一端呈紅綠融合信號(hào)，提示為16和17號(hào)染色體易位所致的衍生16號(hào)染色體，并且表明17號(hào)染色體斷裂位點(diǎn)位于RARα基因的上方。（3）FISH檢測(cè)16q斷裂點(diǎn)：同時(shí)應(yīng)用16號(hào)著絲粒探針（紅色）和一條16q亞端粒探針（綠色）進(jìn)行雙色FISH檢測(cè)，結(jié)果顯示：一條較小的染色體上同時(shí)呈現(xiàn)一個(gè)紅色信號(hào)以及一個(gè)小的綠色信號(hào)提示為正常的16號(hào)染色體，另一條衍生16號(hào)染色體中間可見(jiàn)一個(gè)紅色信號(hào)而在長(zhǎng)臂中段可見(jiàn)綠色信號(hào)，提示16

11、號(hào)染色體的斷裂位點(diǎn)位于q24。17號(hào)上p53探針檢測(cè)顯示SH—2細(xì)胞中期相一條17號(hào)染色體上存在2個(gè)綠色熒光信號(hào)為p53信號(hào)，而另一條17號(hào)染色體缺失。PCR擴(kuò)增p53基因5、6、7和8號(hào)外顯子所得產(chǎn)物經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)有p53基因的5號(hào)外顯子存在突變，自p53基因起動(dòng)子開(kāi)始的第576號(hào)堿基G→T，密碼子CAG→CAT，相應(yīng)編碼的氨基酸在192位處由谷氨酸→組氨酸。 多色FISH：產(chǎn)用Vysis Spectra VysionTMM—

12、FISH探針試劑盒，應(yīng)用5種熒光素SpectrumGold、SpectrumFred、SpectrumAqua、SpectrumRed和SpectrumGreen按缺口平移法對(duì)每一種染色體進(jìn)行不同的組合標(biāo)記，制備成探針池，均顯示一條16號(hào)染色體長(zhǎng)臂末端有來(lái)源于17號(hào)染色體的片段，三條19號(hào)染色體，Y染色體缺失。檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了染色體核型分析結(jié)果。 7、SH—2細(xì)胞集落形成能力 9、各種細(xì)胞因子對(duì)SH—2細(xì)胞的增殖效應(yīng)

13、 10、SH—2細(xì)胞的多藥耐藥研究 結(jié)果:分析采用Genescan3.1系統(tǒng)?；颊叱踉\時(shí)染色體核型分析顯示除45，X，—Y，der（16）t（16；17）（q24； q12），—17，+19外還存在少量正常核型的細(xì)胞，長(zhǎng)期培養(yǎng)的SH—2細(xì)胞系染色體分析僅見(jiàn)包括Y染色體缺失在內(nèi)的異常核型的細(xì)胞，因此在SH—2細(xì)胞系STR檢測(cè)分析結(jié)果盡見(jiàn)X染色體信號(hào)，而無(wú)Y染色體信號(hào)，D8S1179、D21S11、D18S51等九個(gè)STR位點(diǎn)基因

14、型與受體原來(lái)的信號(hào)相一致，證明SH—2細(xì)胞系與患者基因型為同一來(lái)源，排除了細(xì)胞系之間污染的可能。12、致瘤性8只裸鼠皮下接種SH—2細(xì)胞8周，5只裸鼠皮下觀察到實(shí)體瘤生成。腫瘤組織石蠟病理切片，經(jīng)HE染色后鏡下觀察可見(jiàn)多由白血病細(xì)胞組成。取腫瘤組織磨碎后推片，瑞氏染色后鏡下所見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)保持原有的粒細(xì)胞特征；另外腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞免疫表型表達(dá)人白細(xì)胞抗原CD45為98.56%陽(yáng)性，其他標(biāo)志與培養(yǎng)的細(xì)胞系完全一致。從實(shí)體瘤取出細(xì)胞進(jìn)行核型分析：

15、染色體數(shù)目分別為：94=292=591=190=189=288=187=283=182=181=177=3。核型為近四倍體（77～94），XX，—Y，—Y，1q—×2，+1，der（16）t（16；17）×2，—17，—17，+19，+19[20]13、t（16；17）（q24； q12）斷裂點(diǎn)的精確定位，通過(guò)BAC系列探針，確定16號(hào)染色體斷裂點(diǎn)位于克隆RP11—356C4（16q24.3）內(nèi)部或其端粒側(cè)；17號(hào)染色體斷裂點(diǎn)位于克隆R

16、P1—161P9與RP11—47L3之間（17q12）。 結(jié)論: 我們建立了一個(gè)具有t（16；17）（q24；q12）不平衡易位的急性髓系白血病細(xì)胞系。t（16；17）（q24；q12）是一種新的罕見(jiàn)的髓系白血病相關(guān)染色體易位，可能提示預(yù)后不良。具有t（16；17）（q24； q12）不平衡易位的白血病細(xì)胞系SH—2細(xì)胞主要表達(dá)髓系、NK系抗原。建系初期核型為：45，X，—Y，der（16）t（16；17），—17，+1

17、9；培養(yǎng)22個(gè)月后全部轉(zhuǎn)為包括2個(gè)t（16；17）易位所致衍生16號(hào)染色體在內(nèi)的近四倍體核型。衍生16號(hào)染色體的長(zhǎng)臂斷裂位點(diǎn)位于CBFp所在的位點(diǎn)16q22以下，定位于16q24.3上克隆RP11—356C4（16q24）內(nèi)部或其端粒側(cè)：17號(hào)染色體斷裂位點(diǎn)位于RARα基因的上方，定位于17q12上克隆RPl—161P9與RP11—47L3之間（17q12）。IL—3、IL—6、SCF、GM—CSF、IL—4和IL—5可明顯促進(jìn)SH—2