anisomycin通過JNK-miRNAlet-7c-AP-1-STAT1-STAT3信號(hào)誘導(dǎo)JurkatT細(xì)胞凋亡.pdf

1、背景：microRNAs(miRNAs)是一類在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)基因表達(dá)的非編碼小RNA分子,已有研究表明miRNAs與凋亡關(guān)系密切。anisomycin由鏈霉菌（Streptomyces griseolus）分泌，能與60S核糖體中亞單位28S rRNA結(jié)合并阻斷肽鍵形成，從而阻止肽鏈延長和導(dǎo)致多核糖體降解。此前本課題組已篩選并鑒定出在anisomycin誘導(dǎo)人類急性T淋巴細(xì)胞性白血病(Jurkat T)細(xì)胞凋亡中顯著差異表達(dá)的miRN

2、A let-7c。然而，let-7c被anisomycin刺激表達(dá)上調(diào)后，它是如何介導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡的以及與JNK通路是否存在關(guān)聯(lián)尚不清楚。
　　目的：深入闡明miRNA let-7c(let-7c)在anisomycin誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡中的作用與可能機(jī)制，以期為anisomycin臨床應(yīng)用于治療白血病提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：建立anisomycin體外誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡的模型。a

3、nisomycin處理細(xì)胞前加入JNK信號(hào)通路特異性阻斷劑SP600125，qPCR檢測let-7c的變化，以探明JNK信號(hào)與let-7c之間是否存在關(guān)聯(lián)；通過分別轉(zhuǎn)染let-7c-mimic、let-7c-inhibitor和let-7c過表達(dá)載體，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析let-7c在anisomycin誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡中的作用，用Western Blot觀察let-7c對凋亡相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子AP-1、P-AP-1、STAT1、P

4、-STAT1、STAT3、P-STAT3和凋亡相關(guān)蛋白Bim、P-Bim、Bcl-xL、P-Bcl-xL表達(dá)的影響，以確定anisomycin是否通過let-7c影響這些凋亡相關(guān)因子;進(jìn)一步采用RT-PCR、qPCR和Western Blot確證let-7c與Bim和Bcl-xL的關(guān)聯(lián)；再利用siRNA技術(shù)沉默Jurkat T細(xì)胞中的bim基因，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)、qPCR和Western Blot確證Bim是否在let-7c介導(dǎo)aniso

5、mycin誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用；最后，通過Western Blot和原位免疫熒光染色觀察Bim能否影響Jurkat T細(xì)胞中活化的Bax和Bak的表達(dá)與分布，以弄清Bim激活的下游分子及其作用。
　　結(jié)果：anisomycin顯著上調(diào)miRNA let-7c的表達(dá)，但是這種作用可被JNK通路阻斷劑SP600125部分逆轉(zhuǎn)。anisomycin明顯增加Jurkat T細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞比例，轉(zhuǎn)染let-7c

6、-mimic或let-7c過表達(dá)載體均可發(fā)揮類似的促凋亡作用，而轉(zhuǎn)染let-7c-inhibitor可部分逆轉(zhuǎn)anisomycin誘導(dǎo)的凋亡。let-7c-mimic、let-7c過表達(dá)或anisomycin都能上調(diào)P-AP-1和P-STAT1蛋白水平，而 anisomycin的上調(diào)作用可被 let-7c-inhibitor部分逆轉(zhuǎn)。相反，P-STAT3表達(dá)被let-7c-mimic、let-7c過表達(dá)載體或anisomycin抑制，而

7、let-7c-inhibitor卻能逆轉(zhuǎn)anisomycin的抑制作用。同時(shí)，無論anisomycin還是let-7c-mimic和let-7c-inhibitor均不改變非磷酸化的AP-1、STAT1和STAT3。 let-7c-mimic能夠上調(diào)Bim mRNA、蛋白和磷酸化水平，而下調(diào)Bcl-xL mRNA和蛋白水平，但不影響P-Bcl-xL的表達(dá)。低敲bim基因能明顯減少anisomycin誘導(dǎo)的Jurkat T細(xì)胞凋亡，抑制a