前列腺癌冷凍治療后高遷移率族蛋白B1影響DC凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 探討前列腺癌細(xì)胞系氬氦冷凍消融處理后高遷移率族蛋白B1(high mobilitygroup protein B1，HMGB1)的釋放規(guī)律，以及HMGB1誘導(dǎo)異體外周血來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)凋亡的分子機(jī)制。
　　 材料和方法：
　　 前列腺癌細(xì)胞系PC-3、DU-145體外培養(yǎng)，氬氦冷凍消融系統(tǒng)（Endocare氬氦冷凍系統(tǒng)，美國(guó)，直徑1.7mm冷凍器）凍融腫瘤細(xì)胞，收

2、集冷凍壞死細(xì)胞上清液，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)冷凍處理前后腫瘤細(xì)胞上清液中HMGB1的濃度。采集前列腺癌患者新鮮外周血（抗凝），應(yīng)用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液，貼壁方法分離出單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，利用重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重組人白介素4(rhIL-4)體外誘導(dǎo)并培養(yǎng)，獲取幼稚DC細(xì)胞(iDC)。流式細(xì)胞儀測(cè)定腫瘤細(xì)胞冷凍壞死液干預(yù)前后的DCs表面TLR-2和TLR-4受體表達(dá)率;預(yù)先使用TL

3、R-2/TLR-4封閉抗體處理iDC，隨后與腫瘤細(xì)胞冷凍壞死液在體外適宜培養(yǎng)條件下共培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定DCs凋亡率。
　　 結(jié)果：
　　 1.PC-3細(xì)胞系的ELISA結(jié)果:1×105/ml組、1×106/ml組、1×107/ml組PC-3細(xì)胞培養(yǎng)基中HMGB1濃度分別為（65.78±4.57）ng/ml、（96.73±7.64）ng/ml、(137.73±13.37) ng/ml，冷凍消融后上清液中HMGB1濃度為（

4、150.88±6.78）ng/ml、（187.3±5.69）ng/ml、（285.2±27.45）ng/ml，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);
　　 2.DU-145細(xì)胞系的ELISA結(jié)果:1×105/ml組、1×106/ml組、1×107/ml組DU-145細(xì)胞培養(yǎng)基中HMGB1濃度分別為（30.44±0.25）ng/ml、（45.78±0.13）ng/ml、(66.82±0.18) ng/ml，冷凍處理后上清液中HMGB

5、1濃度上升至（58.47±0.84）ng/ml、（98.1±4.62）ng/ml、（157.59±32.89）ng/ml，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果:iDC細(xì)胞表面低表達(dá)TLR-2、TLR-4（15.4±3.87Vs.5.17±7.22），腫瘤細(xì)胞冷凍壞死液刺激后表達(dá)率明顯升高(45.2±5.58Vs.11.48±7.55), P＜0.05。
　　 4.流式細(xì)胞術(shù)（Annexin

6、V-FITC）檢測(cè)各干預(yù)組DCs凋亡率:腫瘤細(xì)胞冷凍壞死液與DCs共培養(yǎng)前后，DC細(xì)胞凋亡率（5.25±0.46）％Vs.（73.56±0.90）％;TLR-2、TLR-4抗體封閉后，冷凍壞死細(xì)胞液誘導(dǎo)DCs凋亡率（38.5±8.61）％Vs.(56.85±7.14)％，（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞氬氦冷凍消融后的死亡形式，顯示大部分細(xì)胞呈碎裂壞死狀態(tài)。
　　 2.ELI

7、SA檢測(cè)冷凍消融前后腫瘤細(xì)胞上清液中HMGB1的濃度，結(jié)果顯示:前列腺癌細(xì)胞冷凍消融處理后HMGB1大量釋放，腫瘤細(xì)胞的數(shù)量也是影響HMGB1濃度的因素。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，幼稚DC細(xì)胞低表達(dá)TLR-2和TLR-4受體，前列腺癌細(xì)胞冷凍壞死液可明顯促進(jìn)DC細(xì)胞表面TLR-2和TLR-4受體表達(dá)率。
　　 4.腫瘤細(xì)胞冷凍壞死液與DCs共培養(yǎng)后誘導(dǎo)DC細(xì)胞凋亡;利用TLR-2和TLR-4抗體封閉DC細(xì)胞，明顯抑