siRNA對(duì)食管鱗癌EC9706細(xì)胞中paxillin表達(dá)及遷移能力影響的研究.pdf

1、食管癌是一種較為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,居世界癌癥死亡的第六位。其發(fā)病率受地區(qū)的影響較大,尤其在河南省林州市的發(fā)病率高達(dá)100/10萬(wàn)以上。食管癌的發(fā)生與某些地區(qū)人民的生活習(xí)慣、自然環(huán)境等因素密切相關(guān),但其確切的病因至今未明了。目前食管癌的治療還主要局限在手術(shù)治療、放射治療、藥物治療和免疫治療等方法,但這些方法均不能達(dá)到令人滿意的效果,而腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的作用。siRNA在腫瘤領(lǐng)域中的應(yīng)用是一個(gè)新興發(fā)展的產(chǎn)業(yè)

2、,由于其高效、低毒及快捷等特點(diǎn)而受到醫(yī)學(xué)界同行的廣泛關(guān)注,因此尋找食管癌新的分子治療靶點(diǎn)近年來(lái)愈來(lái)愈受到廣泛關(guān)注。paxillin是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種重要的細(xì)胞黏附因子,是致瘤性酪氨酸激酶的一種底物,可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的移動(dòng)和播散等功能,從而提高腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的能力。多項(xiàng)研究表明paxillin有參與動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)黏著斑、調(diào)節(jié)細(xì)胞的移動(dòng)和播散等功能。而腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移與細(xì)胞的黏附力、移動(dòng)力的改變直接相關(guān),提示paxillin在腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移

3、中起著十分重要的作用。整合素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的關(guān)鍵信號(hào)分子FAK在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起到非常重要的作用。
　　研究發(fā)現(xiàn)FAK在細(xì)胞粘附、運(yùn)動(dòng)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用,而且還調(diào)節(jié)著多細(xì)胞生物的分裂、塵長(zhǎng)、發(fā)育和凋亡等生物學(xué)行為。目前已發(fā)現(xiàn)FAK在人類(lèi)許多不同類(lèi)型的腫瘤中呈過(guò)度表達(dá),而在良性腫瘤或正常組織中無(wú)顯著增高。FAK在腫瘤向惡性侵襲表型演進(jìn)過(guò)程中起重要作用,其與腫瘤侵襲的高度相關(guān)性已在一些研究中得已證實(shí)。paxillin和FAK

4、均是與細(xì)胞粘附相關(guān)的蛋白,是整合素介導(dǎo)的信號(hào)調(diào)控途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵性的信號(hào)分子。近來(lái)研究表明,paxillin和FAK在細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖和生存中起著十分重要的作用。目前,paxillin和FAK蛋白作為整合素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵性的信號(hào)分子,在食管鱗癌、胃癌、大腸癌、肝癌、乳腺癌、喉鱗狀細(xì)胞癌、肺癌等不同的腫瘤組織中的作用均有不同程度的報(bào)道,然而,paxiltin和FAK的聯(lián)合檢測(cè)在食管鱗癌EC9706細(xì)胞中的作用以及利用si

5、RNA技術(shù)抑制paxillin基因的表達(dá)引起的食管鱗癌細(xì)胞相應(yīng)的生物學(xué)行為的變化也未見(jiàn)報(bào)道。
　　因此,本研究利用paxillin siRNA轉(zhuǎn)染食管鱗癌EC9706細(xì)胞,通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)、半定量RT-PCR及Western blotting方法研究paxillin基因表達(dá)的下調(diào)對(duì)食管鱗癌EC9706細(xì)胞中FAK和MMP-2的表達(dá)的影響,初步闡明三者相互調(diào)控之間的關(guān)系,進(jìn)一步通過(guò)Boyden chamber研究其對(duì)細(xì)胞遷移能力的影

6、響。該研究旨在通過(guò)研究食管鱗癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移調(diào)控途徑,進(jìn)一步利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)阻斷信號(hào)途徑中的關(guān)鍵調(diào)控基因,為食管鱗癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供新的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：1.paxillin siRNA轉(zhuǎn)染食管鱗癌EC9706細(xì)胞將paxillin siRNA利用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染食管鱗癌EC9706細(xì)胞,于48h后收集細(xì)胞,用于下面的免疫細(xì)胞化學(xué)、半定量RT-PCR、Western blotting以及細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。
　　2.

7、免疫細(xì)胞化學(xué)分析paxillin和FAK蛋白的表達(dá)將上述收集好的細(xì)胞,分別爬片,然后利用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)paxillin和FAK蛋白的表達(dá)。
　　3.半定量RT-PCR分析paxillin、FAK及MMP-2 mRNA的表達(dá)根據(jù)操作說(shuō)明用Trizol試劑提取總RNA,然后用AMV First Strand DNASynthesis試劑盒合成cDNA第一鏈。利用合成的特異性PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增,利用β-actin作為內(nèi)參。擴(kuò)增結(jié)束進(jìn)

8、行電泳檢測(cè),并利用Gene Tools進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)分析。
　　4.Western blotting分析paxillin、FAK及MMP-2蛋白的表達(dá)將上述收集的細(xì)胞在裂解緩沖液中進(jìn)行裂解。然后將收集的總蛋白于10％SDS-PAGE電泳,通過(guò)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜用含5％脫脂奶粉的PBS-T于室溫封閉2小時(shí),然后分別加一抗(paxillin,FAK,MMP-2及β-actin)于含1％脫脂奶粉的PBS-T進(jìn)行稀釋,

9、接著加兔抗連接辣根過(guò)氧化物酶的二抗,最后用Gene Tools進(jìn)行蛋白相對(duì)表達(dá)量分析。
　　5.Boyden chamber分析轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞遷移能力的變化將各組細(xì)胞接種于上層,Boyden chamber實(shí)驗(yàn)計(jì)算各組穿膜的細(xì)胞數(shù),然后比較轉(zhuǎn)染paxillin siRNA后EC9706細(xì)胞遷移能力的變化。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理免疫細(xì)胞化學(xué)采用χ~2檢驗(yàn);RT-PCR和Western blotting結(jié)果均采用GeneTools軟

10、件進(jìn)行灰度值分析,上述試驗(yàn)均分別重復(fù)三次。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,行單因素方差分析(one-way ANOVA),P<0.05具顯著性。
　　結(jié)果：1.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)paxillin和FAK蛋白的表達(dá)免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,三組細(xì)胞中轉(zhuǎn)染paxillin siRNA組中paxillin和FAK蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最低(P<0.05),而未處理組和轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)照組中其表達(dá)陽(yáng)性

11、細(xì)胞數(shù)較高,但兩者之間統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)差異(P>0.05)。
　　2.半定量RT-PCR分析paxillin、FAK及MMP-2 mRNA的表達(dá)轉(zhuǎn)染paxillin siRNA后,與對(duì)照組及轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染paxillinsiRNA組中的paxillin mRNA的表達(dá)量明顯下調(diào)。此外,FAK及MMP-2 mRNA相對(duì)含量也顯著下調(diào)。
　　3.Western blotting分析paxillin、FAK及MMP-2蛋白的

12、表達(dá)轉(zhuǎn)染paxillin siRNA后,與對(duì)照組及轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染paxillinsiRNA組中的paxillin蛋白的表達(dá)量明顯下調(diào)。此外,FAK及MMP-2蛋白相對(duì)含量也顯著下調(diào)。
　　4.Boyden chamber分析轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞遷移能力的變化結(jié)果表明,與未處理組及轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染paxillin siRNA組穿膜的細(xì)胞數(shù)明顯下降(P<0.05),但未處理組及轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)照組相比,在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)差