內(nèi)源性大麻素2-AG對LPS誘導的尾核神經(jīng)元損傷的保護作用及其機制研究.pdf

1、　　目的：建立一種大鼠尾核神經(jīng)元的原代培養(yǎng)方法,并對其進行形態(tài)學觀察和免疫組織化學鑒定,初步探索內(nèi)源性大麻素2-AG對脂多糖(LPS)所誘導的尾核神經(jīng)元Na、K通道特性變化的影響。探討內(nèi)源性大麻素2-AG介導LPS誘導的尾核神經(jīng)元損害的保護作用的機制及其相關的信號轉(zhuǎn)導通路。
　　方法：(1) 自新生24小時內(nèi)的wistar大鼠新生鼠大腦中分離出尾核,結合酶消化及機械吹打分離尾核神經(jīng)元,進行體外原代神經(jīng)元培養(yǎng)。(2) 采用神經(jīng)元

2、特異性烯醇化酶(NSE)免疫組織化學法對神經(jīng)元進行鑒定,應用酪氨酸羥化酶(TH)免疫組織化學法對多巴胺(DA)能神經(jīng)元進行鑒定。(3) 用全細胞膜片鉗技術記錄電壓門控鈉通道電流和電壓門控鉀通道(Kv)電流。(4) 采用Hochest染色觀察2-AG對LPS所誘導的尾核神經(jīng)元神經(jīng)毒效應的影響。(5) Caspase 3 活性檢測試劑盒檢測2-AG 對LPS誘導的尾核神經(jīng)元Caspase-3活性的影響。(6) 用western blot測定

3、ErkⅠ/Ⅱ、phosph-ErkⅠ/Ⅱ、p38MAPK、phosph-p38MAPK 、NF-κB 、p-NF-κB、COX-2的蛋白含量。
　　結果：(1) 從新生鼠分離的尾核神經(jīng)元在本實驗條件下生長良好。原代培養(yǎng)7~11天的尾核神經(jīng)細胞在形態(tài)上趨向成熟。 (2) NSE免疫組織化學染色和TH免疫組織化學染色結果顯示所培養(yǎng)細胞90%以上為多巴胺能神經(jīng)元細胞。(3) 分離出的神經(jīng)元形態(tài)正常,細胞膜光滑有彈性,保存了主要離子通

4、道的活性。LPS處理后鈉通道激活曲線明顯左移,激活閾值降低；LPS 同時加2-AG 處理后,該現(xiàn)象消失。但LPS對鈉電流的失活沒有影響 (4) LPS處理12小時后,尾核神經(jīng)元表現(xiàn)出典型的凋亡特征,LPS同時加入2-AG,核固縮細胞的數(shù)目明顯減少。(5) 經(jīng)過LPS處理后尾核細胞的Caspase-3活性顯著增強,2-AG可部分抑制LPS誘導的這種Caspase-3活性的增強,CB1受體的拮抗劑SR1可取消2-AG的這種效應。(6)內(nèi)源性

5、大麻素2-AG可抑制COX-2、phosph-ErkⅠ/Ⅱ、p-NF-κB、phosph-p38MAPK的表達,該作用至少部分由CB1受體介導。
　　結論：成功建立體外原代培養(yǎng)尾核神經(jīng)元模型,細胞飽滿,細胞膜光滑有彈性。2-AG可以抵抗LPS誘導的尾核神經(jīng)元損傷。2-AG對LPS誘導的尾核神經(jīng)元的損害的保護作用可能是通過抑制COX-2的表達來實現(xiàn)的,且CB1受體介導了這一效應 。而該保護作用可能與MAPK/NF-κB信號傳導通