鼻咽癌差異表達(dá)microRNAs篩選研究.pdf

1、鼻咽癌是我國(guó)華南地區(qū)最常見的惡性腫瘤之一，流行病學(xué)調(diào)查和病因?qū)W研究顯示，其發(fā)病與環(huán)境、遺傳、EB病毒感染等因素的作用密切相關(guān)，但具體的分子機(jī)制尚不清楚。 MicroRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)約19nt～23nt的單鏈非編碼RNA，廣泛存在于植物及動(dòng)物中，具有物種及組織特異性，進(jìn)化上高度保守。miRNA可與其靶mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’untranslated regions，3’-UTRs)特異性結(jié)合，引起靶mRNA的翻譯抑

2、制或降解，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及死亡過程中發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用。本研究擬應(yīng)用miRNAs芯片篩選原代培養(yǎng)的鼻咽癌細(xì)胞差異表達(dá)miRNAs，并尋找差異表達(dá)miRNAs調(diào)控的靶基因，為進(jìn)一步研究其在鼻咽癌發(fā)病機(jī)制中的作用打下基礎(chǔ)。 材料和方法 取原代培養(yǎng)的鼻咽癌細(xì)胞和正常鼻咽上皮細(xì)胞，Trizol法抽提總RNA并分離出miRNA；將Cy3熒光標(biāo)記的miRNA進(jìn)行miRNA芯片雜交反應(yīng)：采集芯片原始信號(hào)值并將圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為

3、數(shù)字信號(hào)，導(dǎo)入Cluster 3.0進(jìn)行聚類分析和SAM篩選差異表達(dá)miRNAs；應(yīng)用定量RT-PCR方法驗(yàn)證miRNA芯片結(jié)果的可靠性。運(yùn)用靶基因預(yù)測(cè)軟件并結(jié)合全基因組表達(dá)譜芯片結(jié)果預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNAs可能調(diào)控的靶基因，并對(duì)靶基因進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。結(jié)果miRNAs芯片結(jié)果顯示，鼻咽細(xì)胞中有存在一些高表達(dá)的miRNA，這些miRNA包括let-7家族，miR-21，miR-23，miR-24，miR-29a等；相對(duì)于

4、正常鼻咽粘膜上皮細(xì)胞，鼻咽癌中miR-203、miR-503、miR-424、miR-141和miR-148a表達(dá)下調(diào)，而miR-25、miR-195和miR-15a表達(dá)上調(diào)，其差異表達(dá)均在2倍以上；熒光定量PCR結(jié)果與miRNAs芯片的結(jié)果較符合；在鼻咽癌下調(diào)表達(dá)的miR-203，其預(yù)測(cè)的靶基因?yàn)镃CNG1和SPARC，Western blot結(jié)果顯示，其在原代培養(yǎng)的鼻咽癌細(xì)胞亦高表達(dá)。 結(jié)論 鼻咽癌細(xì)胞中存在差異表達(dá)

5、miRNAs，這些miRNA包括miR-203、miR-503、miR-424、miR-141、miR-148a、miR-25、miR-195和miR-15a等，提示這些miRNA可能與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可作為鼻咽癌的候選標(biāo)記物；應(yīng)用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)鼻咽癌細(xì)胞差異表達(dá)miRNA靶基因，發(fā)現(xiàn)它們靶點(diǎn)非常廣泛，涉及到癌基因，細(xì)胞周期調(diào)控，細(xì)胞分化，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因等；CCNG1和SPARC可能是miR-203調(diào)控的靶基因之一