尾加壓素Ⅱ通過Smad2-3誘導(dǎo)血管成纖維細(xì)胞遷移及膠原合成.pdf

1、目的:我們課題組前期發(fā)現(xiàn)，尾加壓素II（urotensin II, UII）能夠激活血管外膜成纖維細(xì)胞（adventitial fibroblasts，AFs）表型轉(zhuǎn)化和Smad2/3活化。本研究在前期基礎(chǔ)上，采用體外培養(yǎng)的AFs，進(jìn)一步研究UII激活Smad2/3細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)位的受體調(diào)控機(jī)制，并論證Smad2/3在UII刺激AFs膠原合成及細(xì)胞遷移的作用，以揭示UII促進(jìn)血管纖維化發(fā)展的新機(jī)制，為防止血管纖維化的進(jìn)展提供新的策略和實(shí)驗(yàn)依

2、據(jù)。
　　方法:在體外培養(yǎng)的SD大鼠主動脈AFs上，用UII（10-8mol/l）刺激24小時(shí)，觀察UII對Smad2/3核轉(zhuǎn)位的影響。為了探討其作用是否通過UII受體發(fā)揮作用，在研究UII作用時(shí)，提前30分加入U(xiǎn)T阻斷劑SB710411(10-6mol/l)，共同孵育至24小時(shí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，采用免疫熒光測定細(xì)胞中Smad2/3的磷酸化水平（p-Smad2/3）及核轉(zhuǎn)位；采用RNA干擾技術(shù)，分別使Smad2和Smad3基因沉默，采

3、用實(shí)時(shí)定量PCR、免疫熒光來檢測AFs中α-SMA的表達(dá)情況；采用蛋白印跡、實(shí)時(shí)定量PCR及酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法檢測前膠原I（procollagen1）的表達(dá)及I型膠原蛋白（collagen1）的分泌；采用transwell的方法檢測細(xì)胞的遷移能力。
　　結(jié)果：1.免疫熒光技術(shù)顯示UII促進(jìn)AFs表達(dá)p-Smad2/3，采用10-8mol/l UII分別刺激成纖維細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞中p-Smad2/3的蛋白表達(dá)量增加，細(xì)胞核的表

4、達(dá)量增加明顯，UII刺激Smad2/3磷酸化及核轉(zhuǎn)位的效應(yīng)能被UII受體阻斷劑SB710411（10-6 mol/l）所抑制；2.通過RNA干擾使Smad2和Smad3基因分別沉默，可以明顯減弱UII誘導(dǎo)的α-SMA基因表達(dá)，分別較 UII組降低73.26％（P<0.05）和72.29%（P<0.01）；3.通過RNA干擾使Smad2和Smad3基因分別沉默，可以減弱UII誘導(dǎo)的procollagen1表達(dá)，其中蛋白表達(dá)較UII組分別降

5、低54.30%（P<0.001）和47.28%（P<0.001），基因表達(dá)分別降低38.03%（P<0.01）和47.88%（P<0.01），此外，分泌到上清中的collagen1分別較UII組降低34.64%（P<0.01）和41.43%（P<0.01）；4.通過RNA干擾使Smad2和Smad3基因分別沉默，可明顯減弱UII誘導(dǎo)的AFs的遷移能力，Smad2和Smad3 siRNA處理組分別較UII組降低46.39%（P<0.05）