辛伐他汀對(duì)精氨酸加壓素誘導(dǎo)大鼠心臟成纖維細(xì)胞增殖的影響及與小窩蛋白-1關(guān)系的研究.pdf

1、研究背景及目的高血壓是心血管疾病發(fā)生重要的危險(xiǎn)因素，而左室肥厚（LVH）是導(dǎo)致高血壓患者心血管事件發(fā)生率顯著增加獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，也是心臟功能由代償向失代償轉(zhuǎn)化重要的病理表現(xiàn)。因此，心臟重構(gòu)的發(fā)病機(jī)制和防治研究已成為國(guó)內(nèi)外熱點(diǎn)研究課題?，F(xiàn)已明確，神經(jīng)體液因素的異常激活是心臟重構(gòu)發(fā)生的重要機(jī)制。精氨酸加壓素（AVP）是與心血管疾病相關(guān)的重要的神經(jīng)體液因子。已有研究顯示，AVP可誘導(dǎo)新生大鼠心臟成纖維細(xì)胞（CFs）增殖，但對(duì)其誘導(dǎo)CFs增殖的

2、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程仍不十分清楚。他汀類(lèi)藥物是目前防治高脂血癥等高血壓發(fā)病危險(xiǎn)因素的主要藥物之一。大量研究表明，他汀還具有防治心肌纖維化等諸多非調(diào)脂作用。研究發(fā)現(xiàn)，他汀類(lèi)藥物可抑制心肌細(xì)胞肥大以及CFs增殖和膠原合成；在自發(fā)性高血壓大鼠模型中也證實(shí)，辛伐他?。⊿im）可延緩心肌肥厚的發(fā)展。這些研究提示，他汀類(lèi)藥物可調(diào)控心臟重構(gòu)過(guò)程，但其分子機(jī)制仍不十分清楚。晚近研究發(fā)現(xiàn)，小窩是細(xì)胞膜上的結(jié)構(gòu)，它不僅具有儲(chǔ)存和運(yùn)輸內(nèi)源性膽固醇的作用，同時(shí)還是細(xì)胞

3、信號(hào)分子富集和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的樞紐，其主要的標(biāo)志蛋白——小窩蛋白對(duì)許多關(guān)鍵信號(hào)分子的活性狀態(tài)起直接的負(fù)性調(diào)控作用。目前，他汀類(lèi)藥物抑制心肌纖維化過(guò)程是否受到細(xì)胞膜上的小窩的影響，目前尚不明確。小窩蛋白在CFs增殖中的變化尚為未知數(shù)。本課題研究AVP誘導(dǎo)成年大鼠CFs增殖情況及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（erk1/2）信號(hào)通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)特點(diǎn)；Sim干預(yù)后erk1/2通路轉(zhuǎn)導(dǎo)變化及其與小窩蛋白-1（cav1）的關(guān)系，探討Sim抑制CFs增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，

4、膽固醇變化對(duì)細(xì)胞膜上cav1表達(dá)的影響、對(duì)Sim干預(yù)AVP誘導(dǎo)的CFs增殖的作用，旨在闡明高血壓心臟重構(gòu)的發(fā)病機(jī)制，為他汀類(lèi)藥物防治心臟重構(gòu)的分子機(jī)制提供新認(rèn)識(shí)，亦為高血壓心臟重構(gòu)的防治提供新思路和理論依據(jù)。
　　研究方法本研究以體外培養(yǎng)的成年Sprague-Dawley(SD)大鼠CFs增殖為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，采用[3H]-脫氧胸腺嘧啶苷酸摻入、流式細(xì)胞技術(shù)、體外激酶測(cè)定、Westernblot、RT-PCR等方法和技術(shù)，觀察和研究一下

5、幾項(xiàng)：(1)AVP對(duì)CFs增殖的影響；(2)PKC和erk1/2信號(hào)途徑在AVP誘導(dǎo)CFs增殖中的作用；(3)Sim對(duì)CFs增殖的影響；(4)Sim對(duì)CFs增殖中PKC和erk1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控效應(yīng)；(5)cav1在Sim干預(yù)AVP誘導(dǎo)的CFs增殖中的變化；(6)外源性膽固醇對(duì)Sim調(diào)控CFs增殖的影響及其與cav1的關(guān)系。
　　研究結(jié)果(1)給予10-9～10-6mol/L的AVP作用大鼠CFs24h后，隨著AVP濃度的升高，

6、CFs內(nèi)的[3H]-TdR摻入率呈增加趨勢(shì)。其中10-7mol/L和10-6mol/L的AVP干預(yù)組[3H]-TdR摻入率較對(duì)照組（100.0±5.1）％分別增加（172.0±4.0）％和（258.0±19.1）％（P<0.05）。(2)AVP的V1受體阻斷劑d(CH2)5[Tyr2(Me),Arg8]-vasopressin與0.1μmol/L的AVP共同干預(yù)大鼠CFs后的[3H]-TdR摻入率相當(dāng)于空白對(duì)照組（100.0±6.0）％

7、的（103.7±10.5）％，與10-7mol/LAVP單獨(dú)干預(yù)組的（173.5±5.1）％相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（P<0.05）。而V2受體阻斷劑desglycinamide-[d(CH2)5，D-Ile2,Ile4,Arg8]-vasopressin對(duì)AVP干預(yù)下大鼠CFs[3H]-TdR摻入率為（165.7±9.6）％，無(wú)明顯影響（P>0.05）。(3)AVP可上調(diào)CFs內(nèi)erk1/2活性，其活性在5min后達(dá)峰值，隨后逐漸下降，至

8、2h時(shí)逐漸趨近于基線(xiàn)水平。(4)PD98059預(yù)處理后[3H]-TdR摻入率為（116.0±3.2）％，可明顯抑制0.1μmol/L的AVP對(duì)大鼠CFs內(nèi)的誘導(dǎo)作用（P<0.05）。(5)30nmol/L的佛波酯（PMA）或0.1μmol/L的AVP干預(yù)大鼠CFs5min可顯著增強(qiáng)大鼠CFs內(nèi)的erk1/2活性，大鼠CFs內(nèi)的erk1/2活性分別相當(dāng)于對(duì)照組的（5.1±0.6）倍和（4.8±0.2）倍（P<0.05）。而在用2.5μmo

9、l/L的PMA孵育大鼠CFs24h耗竭PKC后，大鼠CFs內(nèi)的erk1/2活性相當(dāng)于對(duì)照組的（2.1±0.3）倍，可顯著抑制AVP誘導(dǎo)的erk1/2激活（P<0.05）。(6)PKC抑制劑－鈣感光蛋白可顯著抑制0.1μmol/L的AVP誘導(dǎo)的大鼠CFs內(nèi)[3H]-TdR摻入率，相當(dāng)于對(duì)照組的（116.0±3.2）％（P<0.05）。(7)AVP可上調(diào)CFs內(nèi)PKC活性，其活性在5min后達(dá)峰值，至30min時(shí)降至基線(xiàn)水平。(8)Ca2+

10、螯合劑BAPTA與0.1μmol/L的AVP共同干預(yù)大鼠CF，其[3H]-TdR摻入率相當(dāng)于對(duì)照組的（154.2±5.9）％，與0.1μmol/L的AVP單獨(dú)干預(yù)組的（168.8±10.1）％相比，沒(méi)有顯著影響（P>0.05）。(9)0.1μmol/L的AVP作用大鼠CFs24h后，CFs內(nèi)的p27kip1蛋白表達(dá)量相當(dāng)于對(duì)照組的（21.7±1.6）％，而細(xì)胞周期蛋白D1、A、E表達(dá)量分別相當(dāng)于對(duì)照組的（5.7±0.5）倍、（5.4±0

11、.5）倍和（6.0±0.7）倍，與對(duì)照組相比，均有顯著的差異（P<0.05）。PD98059可顯著抑制AVP對(duì)p27kip1、細(xì)胞周期蛋白D1、A、E的干預(yù)效應(yīng)，CFs內(nèi)的p27kip1蛋白表達(dá)量相當(dāng)于對(duì)照組的（102.0±5.0）％，細(xì)胞周期蛋白D1、A、E表達(dá)量分別相當(dāng)于對(duì)照組的（1.4±0.2）倍、（2.1±0.3）倍和（3.0±0.3）倍，與AVP組相比，均P<0.05。(10)0.1μmol/L的AVP干預(yù)24h后，細(xì)胞周期由

12、G0/G1期進(jìn)入S期增加，同時(shí)伴有細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）增大（P<0.05）。PD98059可顯著抑制AVP干預(yù)下的S期細(xì)胞百分比和PI指數(shù)增加（P<0.05）。(11)在用10-8～10-5mol/L的Sim預(yù)處理24h后，再用0.1μmol/L的AVP干預(yù)24h，CFs的[3H]-TdR摻入率分別相當(dāng)于對(duì)照組的（172.0±9.8）％、（151.3±7.7）％、（128.3±7.6）％和（121.7±11.5）％，其中10-7～10-

13、5mol/L的Sim組較AVP單獨(dú)作用組的（176.8±9.3）％顯著降低（P<0.05）。(12)10-8～10-5mol/L的Sim與10-7mol/L的AVP聯(lián)合作用CFs24h，隨著刺激濃度的升高，CFs的S期細(xì)胞百分率和PI呈遞減趨勢(shì)，其中10-7mol/L、10-6mol/LSim與AVP共同干預(yù)組顯著低于AVP單獨(dú)作用組（均P<0.05）；10-8mol/LSim與AVP共同干預(yù)組PI指數(shù)顯著低于AVP單獨(dú)作用組(P<0.

14、05)。(13)10-8～10-5mol/L的Sim預(yù)處理大鼠CFs24h后，再用AVP干預(yù)大鼠CFs5min，CFs的erk1/2活性分別相當(dāng)于對(duì)照組的（2.5±0.2）倍、（1.9±0.1）倍、（1.5±0.1）倍和（1.3±0.1）倍，其中10-7～10-5mol/L的Sim與AVP共同干預(yù)組CFs顯著低于AVP單獨(dú)作用組（P<0.05）。(14)在10-8～10-5mol/L的Sim預(yù)處理大鼠CFs24h后，再用AVP干預(yù)大鼠C

15、Fs5min，CFs的PKC活性分別相當(dāng)于AVP單獨(dú)作用組的（24.8±2.4）％、（21.5±2.6）％、（17.3±1.8）％和（15.0±1.3）％，其中10-6mol/L和10-5mol/L的Sim與AVP共同干預(yù)組顯著低于AVP單獨(dú)作用組（P<0.05）。(15)MVA預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)10-6mol/L的Sim對(duì)10-7mol/L的AVP誘導(dǎo)作用，使CFs的[3H]-TdR摻入率增加，相當(dāng)于對(duì)照組的（166.2±6.8）％，PKC

16、活性、erk1/2活性增加（均P<0.05）。(16)焦磷酸牛龍牛兒基牛龍牛兒酯（GGPP）可逆轉(zhuǎn)10-6mol/L的Sim對(duì)10-7mol/L的AVP誘導(dǎo)作用，使CFs的[3H]-TdR摻入率增加，相當(dāng)于空白對(duì)照組的(159.8±7.7)％(P<0.05)；erk1/2激活，相當(dāng)于空白對(duì)照組的(5.2±0.4)倍，而焦磷酸法尼酯（FPP）對(duì)AVP誘導(dǎo)的[3H]-TdR摻入率增加和erk1/2激活沒(méi)有明顯影響。(17)10-7mol/L

17、的Sim可顯著抑制10-7mol/LAVP誘導(dǎo)的大鼠CFs內(nèi)磷酸化肌球蛋白結(jié)合亞基（MBS-P）表達(dá)，相當(dāng)于對(duì)照組的（1.9±0.1）倍（P<0.05）。(18)用10μmol/L的GGPP抑制劑GGTI或5μmol/L的ROK激酶特異性抑制劑Y27632預(yù)處理大鼠CFs24h后，繼而加入10-7mol/L的AVP干預(yù)5min，大鼠CFs內(nèi)erk1/2活性分別相當(dāng)于AVP單獨(dú)作用組的(41±4)％和(25±3)％，均較AVP單獨(dú)作用組顯

18、著降低（P<0.05）。(19)cav1反義寡核苷酸可使大鼠CFs的[3H]-TdR摻入率增加，相當(dāng)于空白對(duì)照組的（172.0±4.2）％；erk1/2活性增加，相當(dāng)于空白對(duì)照組的（2.3±0.3）倍；細(xì)胞周期蛋白D1、A、E的表達(dá)量增加，分別相當(dāng)于空白對(duì)照組的（9.3±0.2）倍、（7.6±0.4）倍和（9.1±0.4）倍，p27kip1的表達(dá)量下降，相當(dāng)于空白對(duì)照組的（16.8±2.3）％（均P<0.05）。(20)10-9～10-

19、6mol/L的AVP干預(yù)CFs24h后，cav1蛋白表達(dá)量分別相當(dāng)于AVP單獨(dú)作用組的（86.7±4.6）％、（79.0±8.6）％、（59.7±3.7）％和（46.0±3.1）％。其中10-7mol/L和10-6mol/L的AVP干預(yù)組較對(duì)照組顯著降低（P<0.05）。(21)在用10-8～10-5mol/L的Sim與10-7mol/L的AVP共同干預(yù)大鼠CFs24h后，cav1的表達(dá)量分別相當(dāng)于AVP單獨(dú)作用組的（88.7±2.7）

20、％、（70.3±2.6）％、（60.7±2.2）％和（56.3±1.9）％。其中10-7～10-5mol/L的Sim與10-7mol/LAVP共同作用組與AVP單獨(dú)作用組相比較，均有顯著差異（P<0.05）。10-4mol/L的MVA與10-7mol/L的AVP共同干預(yù)組的cav1蛋白表達(dá)量較AVP單獨(dú)作用組增加（P<0.05）。(22)10、20、30μg/ml膽固醇可使10-6mol/L的Sim與10-7mol/LAVP聯(lián)合作用組c

21、av1蛋白表達(dá)量增加，相當(dāng)于10-7mol/L的AVP組的（108.3±4.3）％、（133.5±5.4）％和（146.0±5.8）％（P<0.05）。(23)用10％的FBS加20μg/ml的膽固醇干預(yù)大鼠CFs24h后，大鼠CFs胞膜上cav1蛋白的表達(dá)量較單用FBS組無(wú)顯著差異（P>0.05）。而在用2％的MβCD預(yù)處理大鼠CFs2h以除去細(xì)胞膜上膽固醇，再加入2％的MβCD-膽固醇干預(yù)大鼠CFs1h后，CFs胞膜上cav1蛋白的

22、表達(dá)量是單用MβCD預(yù)處理組的（2.7±0.2）倍，兩組比較差異顯著（P<0.05）。(24)外源性膽固醇（10、20或30μg/ml膽固醇）干預(yù)大鼠CFs1h后，CFs內(nèi)膽固醇含量分別為（18.4±1.2）μg膽固醇/mg蛋白、（22.0±1.1）μg膽固醇/mg蛋白和（26.4±1.3）μg膽固醇/mg蛋白，可增加2％的MβCD預(yù)處理以及10-7mol/L的AVP與10-6mol/L的Sim聯(lián)合干預(yù)后大鼠CFs內(nèi)的膽固醇含量，[3H

23、]-TdR摻入率降低，分別是未加膽固醇組的（74.0±4.8）％、（62.0±2.9）％和（35.8±4.3）％，而對(duì)10％的FBS干預(yù)后CFs內(nèi)的膽固醇含量及[3H]-TdR摻入率的增加影響較小。(25)在用10-6mol/L的Sim預(yù)處理大鼠CFs24h的同時(shí)加用20μg/ml膽固醇，與AVP+Sim組的相比，可顯著降低大鼠CFs內(nèi)erk1/2活性，相當(dāng)于對(duì)照組的（1.1±0.2）倍（P<0.05）。
　　研究結(jié)論：(1)AV