ZIP2基因過表達對人單核細胞體系THP-1的影響及肺結核外周血單個核細胞中ZIP2的初步研究.pdf

1、研究背景:
　　 鋅是生命有機體維持正常生命活動所必需的微量營養(yǎng)元素之一，它作為多種金屬酶和蛋白的關鍵組分或輔助因子而廣泛參與生命體中許多種重要的生物化學反應，在機體的生長、發(fā)育以及代謝過程中發(fā)揮重要作用。哺乳動物中，兩大鋅轉運體基因家族參與鋅在細胞內(nèi)外的轉運:ZIP和ZnT。ZIP家族蛋白能夠通過增加對胞外的鋅攝取或者促進細胞器內(nèi)的鋅釋放至胞漿，而提高細胞漿內(nèi)的鋅含量;ZnT家族蛋白則是通過增加細胞質(zhì)內(nèi)的鋅外流至胞外以及促進胞

2、漿內(nèi)的鋅進入細胞器內(nèi)區(qū)室化，而降低細胞漿內(nèi)的鋅含量。由于兩大鋅轉運體基因家族在鋅轉運功能方面表現(xiàn)出相反的作用，因此鋅轉運體在維持細胞內(nèi)外鋅的平衡穩(wěn)定起著至關重要作用。
　　 缺鋅會引起生物體免疫功能低下，同時，缺鋅對鋅轉運體的表達會產(chǎn)生重要影響。對小鼠鋅轉運體基因表達分析研究表明，在一些不成熟的免疫細胞中ZIP2活躍表達;幼兒過敏性哮喘患者血清鋅明顯低于正常水平，且外周血單個核細胞(PBMC)中ZIP2mRNA量顯著高于正常水平

3、。提示在免疫細胞中ZIP2可能發(fā)揮一定的作用。肺結核是由結核桿菌引起的慢性傳染病，在機體抵抗力低下時患上肺結核的風險會增加。因此，探討單核細胞中ZIP2過表達對其產(chǎn)生的影響以及研究ZIP2在肺結核患者中表達及其對免疫細胞因子表達產(chǎn)生的影響很有必要，為進一步研究ZIP2在免疫細胞功能方面的研究奠定基礎。
　　 研究目的:
　　 將構建的ZIP2真核表達載體體外轉染至人單核細胞系THP-1中，檢測ZIP2過表達情況，并檢測Z

4、IP2過表達對THP-1細胞中其他鋅轉運體表達、干擾素γ(INF-γ)和白介素6(IL-6)mRNA水平、腫瘤壞死因子α（TNF-α）分泌以及細胞增殖能力的影響;對比肺結核患者及正常人PBMC中ZIP2表達情況，初步探討肺結核中鋅轉運體表達改變情況，并利用siRNA技術干擾肺結核患者PBMC中ZIP2基因表達，檢測ZIP2干擾對INF-γ和IL-6表達的影響。
　　 研究方法:
　　 分離正常人的PBMC，Trizol法

5、提取總RNA，通過RT-PCR的方法獲得ZIP2的cDNA后，將其定向克隆至pEGFP-N1真核表達載體。將構建完成的pEGFP-N1-ZIP2真核表達載體轉染至人單核細胞系THP-1。轉染48h后，Trizol法抽提轉染細胞的總RNA，RT-PCR的方法檢測其中ZIP2的過表達對鋅轉運體ZIP1、ZnT1、ZnT5、ZIP6、ZIP8、ZIP10及INF-γ及IL-6mRNA水平產(chǎn)生的影響;采用雙抗體夾心法ELISA測定轉染后LPS激

6、活時TNF-α的分泌情況;通過MTT實驗檢測ZIP2對細胞增殖的影響。
　　 臨床收集23例肺結核患者以及42例正常人的抗凝外周血液樣本并收取相關臨床資料，同時收集血清并測定血清鋅含量。分離抗凝血的PBMC，Trizol法提取其中總RNA，通過Real-timePCR的方法檢測PBMC中ZIP2mRNA變化，同時利用RT-PCR方法檢測分析其中ZnT1、ZIP6、ZIP1、ZnT5、ZIP10表達情況;利用電穿孔轉染技術將siR

7、NA片段轉染至肺結核患者PBMC中，干擾ZIP2表達，并利用Real-timePCR檢測細胞因子INF-γ及IL-6表達改變情況。
　　 結果:
　　 構建的pEGFP-N1-ZIP2真核表達載體轉染至THP-1細胞后，結果表明THP-1細胞中ZIP2過表達，但ZIP2過表達對ZnT1、ZIP1、ZIP6、ZIP8、ZIP10、ZnT5mRNA量均沒有顯著影響（P＞0.05）;ZIP2過表達使THP-1細胞INF-γ表達

8、下調(diào)(P＜0.05)，而IL-6表達改變沒有顯著差異（P＞0.05）。ZIP2過表達對THP-1細胞分泌的TNF-α和THP-1細胞的增殖能力均沒有顯著影響（P＞0.05）。
　　 肺結核患者的血清鋅含量明顯低于正常對照組（P＜0.05）;Real-timePCR結果顯示肺結核患者PBMC中ZIP2的表達量明顯高于正常對照組(P＜0.003)。RT-PCR結果顯示，肺結核患者中，ZnT1表達上調(diào)(P＜0.00002);ZIP6表

9、達下調(diào)(P＜1.5×10-9);ZIP1、ZnT5表達改變沒有顯著差異(P＞0.05);ZIP10表達下調(diào)（P＜0.003）。利用電穿孔轉染siRNA干擾片段干擾肺結核患者PBMC中ZIP2，Real-timePCR結果顯示，ZIP2干擾效果明顯，并且ZIP2干擾后肺結核患者PBMC中INF-γ表達下調(diào)(P＜0.01)、IL-6表達上調(diào)(P＜0.01)。
　　 結論:
　　 本實驗構建了pEGFP-N1-ZIP2真核表達

10、載體，并將其轉染至THP-1細胞中。轉染48h后，ZIP2過表達對THP-1細胞系中其他鋅轉運體表達、IL-6表達、細胞分泌TNF-α、細胞增殖能力沒有顯著影響，但能使INF-γ表達下調(diào)。
　　 肺結核患者PBMC中ZIP2表達明顯上調(diào)，ZnT1表達明顯上調(diào)，ZIP6、ZIP10表達明顯下調(diào)，ZIP1、ZnT5表達沒有顯著改變;干擾肺結核患者PBMC中ZIP2表達后，INF-γ表達下調(diào)，IL-6表達上調(diào)。ZIP2對肺結核患者淋巴