X射線輻照后對中樞海馬組織損傷作用研究.pdf

1、目的：
　　 構建ICR小鼠X射線全腦輻照模型和離體海馬神經元輻照模型，研究不同劑量X射線照射后不同時間點中樞海馬齒狀回的病理損傷，及其對神經元超微結構的損傷作用、細胞凋亡、DNA雙鏈斷裂、NBS1、ATM、P53、PUMA等DNA損傷修復相關蛋白表達以及細胞周期改變等情況的影響，探討X射線對中樞海馬齒狀回神經的損傷及其機制，為輻射防護提供理論依據。
　　 方法：
　　 健康ICR小鼠80只，體重18～22g，雌

2、雄各半。隨機分為五組（四個不同劑量X射線照射組和一個空白對照組），X射線照射組小鼠麻醉后分別接受0.4Gy、4Gy、10Gy、18GyX射線全腦一次照射，空白對照組小鼠麻醉后作假照射（不予X射線照射）。X射線輻照后4h、12h、24h、48h取小鼠全腦對中樞海馬組織進行檢測（同一劑量X射線照射后每時間點動物數為4只）。運用HE染色檢測顆粒細胞病理損傷，透射電鏡從形態(tài)學上觀察中樞海馬齒狀回顆粒細胞超微結構損傷，原位末端標記(TUNEL)法

3、檢測海馬神經細胞凋亡，單細胞凝膠電泳(SCGE)和γ-H2AX細胞免疫熒光法檢測中樞海馬細胞DNA雙鏈斷裂，免疫組化和免疫蛋白印跡法檢測中樞海馬組織NBS1、ATM、P53，PUMA蛋白表達，流式細胞儀檢測中樞海馬細胞周期改變情況。結果經統(tǒng)計學處理，分析不同劑量X射線照射后不同時間，中樞海馬組織的損傷、NBS1、ATM、P53、PUMA蛋白表達以及細胞周期改變之間的輻射效應關系。
　　 結果：
　　 (1)病理結果顯示，

4、對照組齒狀回顆粒細胞和亞顆粒細胞結構緊密，形態(tài)完整、排列整齊，層次清晰，細胞核飽滿、核仁清晰，無膠質細胞的浸潤。在0.4Gy4h和12h點，齒狀回顆粒細胞與對照組相似；照射組病理損傷隨時間的延長呈遞進性加重，劑量較大組光鏡下可見齒狀回顆粒細胞排列稀疏、紊亂，胞膜皺褶，核碎裂。
　　 (2)電鏡結果顯示，空白對照組中樞海馬細胞內線粒體、內質網等細胞器未見明顯異常，神經元形態(tài)正常，核膜完整，染色質未見濃染。與對照組海馬齒狀回顆粒細胞

5、相比較，0.4Gy組照射后各個時間點齒狀回顆粒細胞形態(tài)無明顯改變，偶見齒狀回顆粒細胞形態(tài)發(fā)生不規(guī)則改變，顆粒細胞核內染色質稍濃。4Gy組照射后4h觀察到海馬齒狀回顆粒細胞形態(tài)不規(guī)則改變，在12h出現局部核膜斷裂，24h和48h出現明顯的線粒體腫脹變性。10Gy組照射后4h與12h觀察到海馬細胞固縮，核型變小，24h點核膜斷裂明顯,48h點細胞核有破裂癥狀。18Gy組照射后4h與12h海馬細胞比10Gy劑量組中相同時間點固縮更加明顯,48

6、h表現更為嚴重，有壞死細胞出現。
　　 (3)單細胞凝膠電泳(SCGE)結果顯示，不同劑量X射線照射后，各組隨時間延長均出現DNA損傷，表現出在4h上升、12h或24h達到高峰、24h或48hDNA損傷參數逐漸下降的趨勢；各劑量組間，DNA損傷隨劑量的增加逐漸加重。
　　 (4)不同劑量X射線照射后不同時間點均可誘發(fā)海馬神經元產生不同程度DSBs。同一照射劑量組中，γ-H2AX焦點數和陽性率均表現為在0.5h內迅速升高，

7、1h達到高峰,4～48h逐漸下降；不同劑量組間，相同時間點γ-H2AX陽性率，均隨劑量增加而加重。
　　 (5)細胞凋亡檢測結果顯示，與對照組相比，輻照組在電離輻射后各時間點海馬齒狀回細胞凋亡數均明顯增多（除0.4Gy組）；細胞凋亡率隨照射劑量增加而增加，并隨時間的延長逐漸增加。0.4Gy組細胞凋亡率4-24h較對照組均略增高，但在48h有所回落；18Gy48h細胞凋亡率急劇降低。
　　 (6)免疫組化結果顯示，X射線照

8、射組在輻照后各個時間點中樞海馬NBS1、ATM、P53陽性細胞數高于對照組，ATM、P53陽性細胞率隨照射劑量增加而升高。在0.4～4Gy劑量組，隨著照射后時間的延長，NBS1蛋白的表達先升高后降低，在10Gy劑量組NBS1蛋白的表達持續(xù)升高。
　　 (7)Western-blot結果顯示，除18Gy48h的ATM、P53、PUMA蛋白表達較18Gy24h回落外，其余各組ATM、P53、PUMA蛋白表達均隨著照射劑量的增加以及時

9、間的延長而增加。照射后同一時間點，NBS1表達隨著照射劑量增大，表達隨之增高；在0.4～4Gy劑量組，隨著照射后時間的延長，NBS1蛋白的表達先升高后降低，在10Gy劑量組NBS1蛋白的表達持續(xù)升高。
　　 (8)細胞周期結果顯示，同一時間點各劑量組劑量組S期細胞明顯增多,4Gy、10Gy、18Gy劑量組G2/M期細胞隨著劑量的增大細胞數逐漸增多。
　　 結論：
　　 (1)0.4Gy、4Gy、10Gy、18Gy

10、X射線全腦輻照后4h、12h、24h、48h不同時間點均可誘發(fā)齒狀回顆粒細胞不同程度病理損傷。0.4Gy劑量4h和12h點，齒狀回顆粒細胞與對照組相似；其余實驗組病理損傷隨時間的延長呈遞進性加重，呈現劑量-效應關系。
　　 (2)0.4Gy、4Gy、10Gy、18GyX射線全腦輻照后4h、12h、24h、48h不同時間點可見齒狀回顆粒細胞有不同程度的超微結構損傷。即使較小劑量0.4Gy照射后，中樞海馬也存在輕微染色質深染；隨著照

11、射劑量的增加，損傷逐漸加重，呈現劑量-時間-效應關系。
　　 (3)0.4Gy、4Gy、10Gy、18GyX射線全腦輻照后4h、12h、24h、48h不同時間點均可誘發(fā)齒狀回顆粒細胞不同程度DNA損傷。同一照射劑量組中，DNA損傷先升高，12h或24h達到高峰，隨后24h或48h逐漸下降，呈現時間-效應關系；不同劑量組間，相同時間點DNA損傷，均隨劑量增加而加重，呈現劑量-效應關系。
　　 (4)不同劑量X射線照射后不同

12、時間點均可誘發(fā)海馬神經元產生不同程度DSBs。同一照射劑量組中，γ-H2AX焦點數和陽性率均表現為在0.5h內迅速升高，1h達到高峰，隨后4～48h逐漸下降，呈現時間-效應關系；不同劑量組間，相同時間點γ-H2AX陽性率，均隨劑量增加而加重，呈現劑量-效應關系。
　　 (5)X射線照射能夠誘導中樞海馬組織發(fā)生細胞凋亡，細胞凋亡率隨照射劑量增加以及時間的延長而逐漸增加，呈劑量—時間—效應關系。
　　 (6)0.4Gy、4G

13、y、10Gy、18GyX射線全腦輻照后4h、12h、24h、48h不同時間點中樞海馬NBS1，ATM、P53、PUMA蛋白表達均隨著劑量的增加而升高，呈現劑量-時間-效應關系，且和DNA損傷的改變有相關關系，提示NBS1、ATM、P53、PUMA蛋白可能參與了DNA的識別和修復過程。
　　 (7)不同劑量X射線輻照后不同時間能夠引起不同程度中樞海馬細胞周期S期、G2/M期發(fā)生阻滯，與照射劑量、照射后時間相關。此外，細胞周期的改變