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文檔簡介
1、第一部分 Wnt10a和Wnt10b在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)和臨床意義
目的:通過檢測(cè)Wnt10a及Wnt10b在不同狀態(tài)子宮內(nèi)膜組織中表達(dá),分析其與子宮內(nèi)膜癌(EC)患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系,探討Wnt10a及Wnt10b在EC發(fā)生發(fā)展中的作用,判斷EC的生物學(xué)行為。為EC病因?qū)W研究及預(yù)后判斷提供科學(xué)依據(jù)。
方法:本研究選取2001年1月至2010年12月在天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科住院的新發(fā)EC標(biāo)本102例。其中包
2、括95例雌激素依賴型(Ⅰ型)子宮內(nèi)膜癌(其中12例子宮內(nèi)膜癌伴鱗狀分化)與7例非雌激素依賴型(Ⅱ型)EC(2例漿乳癌,4例粘液腺癌,1例透明細(xì)胞癌)。對(duì)照組:單純性增生子宮內(nèi)膜(SHE)18例,復(fù)雜性增生子宮內(nèi)膜(CHE)6例,非典型增生子宮內(nèi)膜(AHE)30例,正常子宮內(nèi)膜(NE)84例(其中增生期48例、分泌期36例),所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)證實(shí),其中子宮內(nèi)膜癌標(biāo)本均為原發(fā)病例且術(shù)前未接受過其他方法治療。收集以上標(biāo)本制作組織芯片,應(yīng)用免
3、疫組化SP法檢測(cè)Wnt10a和Wnt10b在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況。采用SPSS14.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用卡方(x2)檢驗(yàn)和Spearman等級(jí)相關(guān)分析,應(yīng)用Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素生存曲線分析。P<0.05視為差異具有顯著性。
結(jié)果:1.Wnt10a在EC組陽性表達(dá)率高于AHE、CHE、SHE及NE組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P>0.05(x2=2.81,P=0.25); Wnt10b在EC、AHE、CH
4、E、SHE及NE組的陽性表達(dá)率逐漸下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05(x2=8.12,P=0.02)。2.Wnt10a在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的陽性表達(dá)率高于非子宮內(nèi)膜樣腺癌,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05(x2=4.75,P=0.03);然而,Wnt10a在EC組織學(xué)分級(jí)、子宮肌層浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及手術(shù)病理分期(FIGO分期)各亞組中的陽性表達(dá)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P>0.05(P=0.36,P=0.75,P=0.37,P=0.54)。Wnt
5、10b在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的陽性表達(dá)率高于非子宮內(nèi)膜樣癌,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05(x2=2.81,P=0.04)。Wnt10b在高分化(G1)、中分化(G2)和低分化(G3)組EC中陽性表達(dá)率逐漸降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05(x2=6.87,P=0.03); Wnt10b在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組陽性表達(dá)率高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組P<0.05(P=0.02); Wnt10b在FIGO分期各亞組中陽性表達(dá)率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0.05(P
6、=0.04); Wnt10b在EC肌層浸潤各亞組中的陽性表達(dá)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P>0.05(x2=2.27,P=0.13)。3.Wnt10a和Wnt10b在EC組織中的表達(dá)無明顯相關(guān)性, P>0.05(rs=0.08,P=0.43)。4預(yù)后分析:對(duì)102例EC患者進(jìn)行隨訪。Wnt10a陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者的預(yù)后沒有明顯差別,P>0.05(x2=0.027,P=0.868)。然而,Wnt10b高表達(dá)組EC患者的預(yù)后好于低表達(dá)組,差異有統(tǒng)計(jì)
7、學(xué)意義,P<0.05(x2=3.952,P=0.047)。
結(jié)論:Wnt10b在EC發(fā)生發(fā)展中很可能起到重要作用。Wnt10b表達(dá)陽性組的患者預(yù)后好于陰性組患者。然而,Wnt10a在EC中的作用仍需要進(jìn)一步研究。
第二部分子宮內(nèi)膜癌與經(jīng)典Wnt信號(hào)通路相關(guān)性的研究
目的:觀察Wnt10b基因通過經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖與凋亡的作用機(jī)理,進(jìn)一步證實(shí)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在EC發(fā)生
8、發(fā)展中的作用,為EC發(fā)病機(jī)理提供理論依據(jù)。
方法:Wnt10b在AN3CA細(xì)胞系中呈低表達(dá)狀態(tài),而在Ishikawa3-H-12細(xì)胞系中呈高表達(dá)狀態(tài)。因此,本研究采用上述兩種EC細(xì)胞系作為體外細(xì)胞模型,觀察了Wnt10b對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)鍵因子β-catenin、APC、c-myc的變化影響。細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代、凍存,均嚴(yán)格按照無菌操作要求進(jìn)行。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖狀態(tài)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。質(zhì)粒
9、轉(zhuǎn)染及siRNA干擾后檢測(cè)Wnt10b在mRNA水平上對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)鍵因子β-catenin、 APC、 c-myc的影響。Western-blot法檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白β-catenin、 APC、 c-myc的表達(dá)含量。數(shù)據(jù)用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析、Fisher精確檢驗(yàn)和t檢驗(yàn),P<0.05視為差異具有顯著性。
結(jié)果:1.Wnt10b對(duì)EC細(xì)胞增殖的影響:
10、在AN3CA細(xì)胞系過表達(dá)Wnt10b后,其細(xì)胞增殖水平明顯高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組;在Ishikawa3-H-12細(xì)胞系敲降Wnt10b,結(jié)果顯示,Wnt10b敲掉組的細(xì)胞增殖水平明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。說明Wnt10b具有促進(jìn)EC細(xì)胞增殖的作用。2.Wnt10b對(duì)EC細(xì)胞凋亡的影響:在本研究中同樣采用AN3CA和Ishikawa3-H-12細(xì)胞系觀察Wnt10b對(duì)EC細(xì)胞凋亡的影響。流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡水平。在AN3
11、CA細(xì)胞中過表達(dá)Wnt10b后,其細(xì)胞凋亡率明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)。與此相對(duì)應(yīng),在Ishikawa3-H-12細(xì)胞中敲降Wnt10b后,其細(xì)胞凋亡率明顯高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.01)。說明Wnt10b具有明顯抑制EC細(xì)胞凋亡的作用。3.Wnt10b對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵因子在轉(zhuǎn)錄水平的影響:(1)在ECAN3CA細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt10b過表達(dá)質(zhì)粒,RT-PCR方法觀察轉(zhuǎn)染效率,Wnt
12、10b表達(dá)明顯增加,說明轉(zhuǎn)染成功。我們發(fā)現(xiàn)β-catenin和c-myc表達(dá)明顯增加,而APC表達(dá)下降。(2)在Ishikawa3-H-12細(xì)胞系中敲降Wnt10b,RT-PCR驗(yàn)證敲降效率比較明顯,β-catenin和c-myc表達(dá)下降,而APC表達(dá)上升。說明Wnt10b在轉(zhuǎn)錄水平上通過活化經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子,誘導(dǎo)靶基因表達(dá),從而促進(jìn)EC細(xì)胞增殖和抑制其凋亡。4.Wnt10b對(duì)Wnt/β-catenin
13、信號(hào)通路關(guān)鍵因子在翻譯水平的影響:(1)在AN3CA細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt10b過表達(dá)質(zhì)粒,Western Blot方法觀察轉(zhuǎn)染效率比較明顯, Wnt10b蛋白表達(dá)明顯增加,同時(shí),β-catenin和c-myc表達(dá)也明顯增加,而APC表達(dá)明顯下降。(2)在Ishikawa3-H-12細(xì)胞系中敲降Wnt10b,Western Blot方法驗(yàn)證敲降效率比較明顯。Wnt10b蛋白表達(dá)明顯下降,同時(shí),β-catenin和c-myc表達(dá)也明顯下降,而
14、APC表達(dá)明顯上升。說明Wnt10b蛋白通過活化經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白,誘導(dǎo)靶基因表達(dá),從而促進(jìn)EC細(xì)胞增殖和抑制其凋亡。
結(jié)論:Wnt10b在EC的發(fā)生發(fā)展中可能起到了重要作用,其機(jī)理涉及經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活及其對(duì)下游基因的調(diào)控。結(jié)合本研究結(jié)果進(jìn)行分析,Wnt10b在EC細(xì)胞中的過表達(dá)可激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路,降低其負(fù)調(diào)控因子APC的表達(dá),促進(jìn)β
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