MicroRNA-126在肝纖維化過(guò)程中對(duì)IκBα基因調(diào)控作用的初步研究.pdf

1、[目的]構(gòu)建穩(wěn)定的包含有MicroRNA-126(miR-126)結(jié)合位點(diǎn)的IκBα基因3'UTR的真核表達(dá)質(zhì)粒載體，并轉(zhuǎn)染至人肝星狀細(xì)胞(LX-2細(xì)胞)，探討miR-126和IκBα在參與肝纖維化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的可能機(jī)制，為進(jìn)一步探索肝纖維化的基因治療提供理論依據(jù)。
　　 [方法]根據(jù)MicroRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件提供的miR-126與IκBα3'UTR的結(jié)合位點(diǎn)，人工合成一段PCR擴(kuò)增引物，同時(shí)設(shè)計(jì)、合成一段突變序列作為對(duì)

2、照組，各自退火形成雙鏈DNA后，分別克隆到含有雙熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒psiCHECK-2 Vectors，構(gòu)建成含有miR-126與IκBα3'UTR結(jié)合位點(diǎn)的重組質(zhì)粒及突變對(duì)照質(zhì)粒，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切瓊脂糖電泳和測(cè)序鑒定。通過(guò)脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)，將構(gòu)建好的質(zhì)粒載體與miR-126共轉(zhuǎn)染人肝星狀細(xì)胞，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，進(jìn)行熒光素酶活性分析。
　　 [結(jié)果](1)PCR擴(kuò)增鑒定證實(shí)目的

3、基因片段分別被成功克隆到質(zhì)粒psiCHECK-2 Vectors中，同時(shí)測(cè)序結(jié)果也證明兩組重組質(zhì)粒的插入序列與設(shè)計(jì)的靶基因片段完全一致。(2)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析測(cè)定結(jié)果顯示：在轉(zhuǎn)染克隆有IκBα基因3'UTR質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組中，miR-126組與空白組及NC陰性對(duì)照組的比較中，熒光素酶的活性明顯受到抑制(P<0.01)，當(dāng)加入miR-126抑制劑后，與miR-126組比較，熒光素酶的活性抑制減弱，與其他組比較熒光素酶的活性差異無(wú)明顯性(

4、P>0.05)，證實(shí)miR-126能與IκBα基因3'UTR結(jié)合，從而抑制熒光素酶的活性；在轉(zhuǎn)染PisCHECKTM-2原質(zhì)粒和克隆有mut Iκdα基因3'UTR質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組中，miR-126組與空白組及NC陰性對(duì)照組比較，熒光素酶的活性變化差異無(wú)顯著性(P>0.05)，證實(shí)miR-126不能與mut Iκdα基因3'UTR結(jié)合，而抑制熒光素酶的活性。
　　 [結(jié)論]成功構(gòu)建包含有miR-126與IκBα3'UTR的結(jié)合位點(diǎn)的