小鼠胸腺T細胞淋巴瘤模型的改進及治療的初步研究.pdf

1、目的：本課題旨在通過調(diào)整給藥方案和實驗周期，進一步提高N-甲基-N-亞硝基脲(MNU)誘導小鼠胸腺淋巴瘤模型的成瘤率并降低死亡率；利用此種動物模型，采用原代培養(yǎng)方法，以期建立一個新的淋巴瘤細胞系/株；以小鼠T淋巴瘤細胞株EL-4細胞株為模型，研究淫羊藿素(ICT)是否抑制其增殖，并就其作用機制做初步探討；研究ICT是否抑制MNU誘導小鼠胸腺T細胞淋巴瘤的裸鼠移植瘤的增殖。 方法： 1.第一部分，選用6～8周齡C57BL/

2、6小鼠80只，隨機分實驗組66只，對照組14只。根據(jù)體重于第1周腹腔內(nèi)注射MNU誘導液，分為3個劑量組(G1、G2、G3)，劑量分別為50、50、100mg/kg體重；對照組(GO)14只，經(jīng)腹腔內(nèi)注射等量生理鹽水(50mg/kg體重)。第5周，G1、G2實驗組第2次經(jīng)腹腔內(nèi)注射MNU誘導液，劑量分別為50、70mg/kg體重；對照組(GO)與G3實驗組經(jīng)腹腔內(nèi)注射等量生理鹽水(50mg/kg體重)。注射后觀察動物一般情況，對瀕死及死亡

3、小鼠進行解剖觀察。第25周采用頸椎脫位法處死全部小鼠，解剖檢查胸腺淋巴瘤的發(fā)生及其他臟器情況。應用光鏡和免疫組織化學方法(所選抗體有CD3、CD20、TdT及PCNA)，對誘發(fā)的胸腺淋巴瘤及其侵襲臟器進行研究并鑒定腫瘤細胞來源、分型。 2.第二部分，在第一部分誘導的胸腺淋巴瘤模型基礎上，采用胰蛋白酶消化法、機械分散法獲取腫瘤細胞混懸液，進行腫瘤細胞原代培養(yǎng)。 3.第三部分，研究ICT體外對EL-4細胞作用及機制：應用MT

4、T比色法檢測ICT對EL-4細胞增殖能力的影響；應用透射電鏡技術、流式細胞術檢測ICT對EL-4細胞凋亡的誘導作用；用RT-PCR技術檢測ICT作用后EL-4細胞Bcl-2、P21基因mRNA表達水平的改變；通過比色法檢測ICT作用后對EL-4細胞Caspase-3、Caspase-9酶活性的影響。 4.第四部分，建立MNU誘導小鼠胸腺T細胞淋巴瘤的裸鼠異種移植瘤模型，研究ICT對移植瘤的作用。設生理鹽水陰性對照組，環(huán)磷酰胺陽性

5、對照組及ICT高、中、低三個濃度組，每組5只裸鼠。高、中、低濃度組分別按每只每次腹腔注射ICT0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg進行給藥，陰性對照組注射等量生理鹽水，每天給藥一次，連續(xù)10天。陽性對照組每只每次腹腔注射10mg/ml，0.2ml(共2mg)環(huán)磷酰胺，隔天給藥一次，共3次。末次給藥后24小時，處死裸鼠。稱量離體瘤塊重量、計算抑瘤率，對瘤組織及心、肝、脾、肺、腎等組織進行病理學檢查，檢測ICT對裸鼠異種移植

6、瘤生長的影響。 結果： 1.第25周，83.3％(55/66)實驗組小鼠產(chǎn)生胸腺淋巴瘤；包括5只死亡小鼠，死亡率7.6％。55例胸腺腫瘤光鏡下主要表現(xiàn)為：胸腺結構破壞，代之以彌漫分布的中等大小淋巴樣細胞，細胞形態(tài)一致，胞質(zhì)稀少，核圓形、卵圓形，染色質(zhì)細膩，核仁顯著，核分裂象多見，可見“星空”現(xiàn)象。免疫組化顯示瘤細胞表達CD3和TdT。 2.采用胰蛋白酶消化法、機械分散法獲取腫瘤細胞混懸液。接種48h后活細胞率由9

7、8％±1.5％降低為30％±3％，無法傳代及繼續(xù)培養(yǎng)。 3.ICT對EL-4細胞的增殖具有明顯的抑制作用：MTT比色法試驗顯示ICT能明顯抑制EL-4細胞增殖，且隨著藥物濃度的升高、作用時間的延長該抑制作用明顯增強，呈量效及時效關系。透射電鏡及流式細胞術結果顯示，ICT可誘導EL-4細胞凋亡。RT-PCR顯示，以40μmol/L的ICT處理EL-4細胞6h后，bcl-2、P21基因的mRNA表達下調(diào)。比色法Caspase-3、C

8、aspase-9酶活性檢測顯示40、80μmol/L ICT作用6h能夠顯著增強EL-4細胞Caspase-3酶活性，也可同時增強Caspase-9酶活性。 4.ICT作用前后，雖然裸鼠移植瘤大小等無明顯差異，但在光鏡下可觀察到ICT中、高劑量組(1.0mg/kg、1.5mg/kg)中均有1例出現(xiàn)明顯增多的固縮細胞及較多核碎屑。 結論： 1.通過調(diào)整給藥方案和實驗周期后腹腔注射MNU，可誘導小鼠產(chǎn)生胸腺T細胞淋巴

9、瘤，成瘤率較之前67.5％提高為83.3％，死亡率較之前10％降低為7.6％。 2.體外原代培養(yǎng)C57BL/6小鼠胸腺T細胞淋巴瘤腫瘤細胞未獲成功，培養(yǎng)條件及方法尚待摸索。 3.ICT可抑制體外培養(yǎng)的小鼠T淋巴瘤EL-4細胞的增殖并誘導其凋亡，可能系通過下調(diào)bcl-2、P21 mRNA表達，激活Caspase-3、Caspase-9蛋白等途徑實現(xiàn)的。 4.ICT體內(nèi)可能誘導淋巴瘤細胞凋亡，但在劑量及給藥方式上尚待