豬偽狂犬病毒變異株B細(xì)胞表位預(yù)測及細(xì)菌人工染色體的構(gòu)建.pdf

1、豬偽狂犬病是由偽狂犬病毒（PRV）感染引起的急性傳染病，可造成母豬繁殖障礙和仔豬的急性死亡。PRV屬于皰疹病毒科α型皰疹病毒亞科豬皰疹病毒I型。成熟的病毒粒子由四部分獨特的結(jié)構(gòu)組成：雙股線狀DNA的核心、二十面體核衣殼、被膜、以及外層的囊膜。偽狂犬病毒的基因組大小約140kb，GC含量約74％，至少含70個基因，約編碼100種蛋白。
　　2011年以來，在我國多地使用偽狂犬病毒基因缺失疫苗株 Bartha-K61免疫過的豬場發(fā)生了

2、疑似偽狂犬病毒感染和發(fā)病現(xiàn)象，經(jīng)調(diào)查和毒株分離鑒定，從這些豬場分離到了抗原性變異的偽狂犬病毒。為了解這些病毒與Bartha-K61抗原性差異的分子基礎(chǔ)，運用MEGA6.0，BepiPred1.0b Server和Bcepred對4個新分離株和7個國外毒株的10種囊膜蛋白gD, gB, gC, gH, gM, gL, gK, gN、UL34、UL43編碼蛋白的氨基酸序列進行了序列比對、進化分析以及B細(xì)胞抗原表位預(yù)測。結(jié)果顯示gD, gB,

3、 gC, gM, gK, gN及UL34、UL43編碼蛋白的氨基酸序列進化樹中，國內(nèi)毒株與國外毒株均處于不同分支；gL蛋白氨基酸序列進化樹中BJ、TJ、ZJ中國株與Becker毒株處于同一分支，gH蛋白的氨基酸序列進化樹中BJ、TJ、ZJ與Bartha毒株處于同一分支，但這兩個蛋白的進化樹中HeN1均與BJ、TJ、ZJ株處于不同分支，表明國內(nèi)PRV分離株獨立進化，且之間存在一定的遺傳差異。B細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果顯示國內(nèi)分離株同Bartha相

4、比共存在31個抗原表位差異，這可能是國內(nèi)分離株抗原性變異分子基礎(chǔ)的重要組成部分。
　　為揭示變異株的抗原性變異的分子機制以及對以上預(yù)測結(jié)果進行實驗驗證，以一株分離于黑龍江的RPV為對象，構(gòu)建了該病毒的表達全長基因組的細(xì)菌人工染色體：首先采用PCR方法擴增出上下游同源臂、EGFP表達盒并同BAC質(zhì)粒一起克隆到pUC18質(zhì)粒，獲得轉(zhuǎn)移載體，后將經(jīng)限制性內(nèi)切酶AcclⅠ處理過的病毒全基因組連同轉(zhuǎn)移載體共同轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，獲得重組病毒