線粒體自噬與自噬在豬瘟病毒感染中的作用機制及豬瘟病毒感染的代謝組學研究.pdf

1、豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）感染引起豬的一種烈性傳染病，具有急性、熱性、高度接觸性等特點，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為A類傳染病。CSFV強毒株感染可導致典型CSF的發(fā)生，臨床上以出血綜合征與免疫抑制為主要特征。近年來由于中等毒力或弱毒CSFV的出現(xiàn)，導致豬群中發(fā)生持續(xù)的隱性帶毒與免疫抑制等狀況，這給 CSF的控制與凈化帶來

2、了更大的困難與挑戰(zhàn)。當CSFV感染豬時，單核巨噬細胞和血管內(nèi)皮細胞雖然是主要的親嗜性細胞，但CSF發(fā)生中出現(xiàn)的免疫抑制主要是由于淋巴B細胞與T細胞的大量減少造成的。淋巴細胞的減少除了與體內(nèi)的細胞因子紊亂有關(guān)外，凋亡的觸發(fā)也起著重要作用。研究表明，CSFV可通過抑制宿主細胞干擾素的產(chǎn)生與細胞凋亡，實現(xiàn)對親嗜性細胞的持續(xù)感染與病毒的大量復(fù)制。近年來，有關(guān)CSFV與宿主細胞相互博弈的研究雖然在不斷深入，但有關(guān)CSF的發(fā)病機制與免疫功能紊亂機制

3、仍不清楚。因此，開展CSF的致病機制，特別是CSFV免疫逃逸機制的研究，對CSF的防控具有十分重要的意義。
　　自噬是細胞進化中非常保守的一種防御機制，在病毒感染過程中具有十分重要的作用。最新研究表明，多種病毒都可通過誘導線粒體自噬對細胞內(nèi)損傷的線粒體進行清除。另有研究表明，自噬對細胞凋亡、細胞內(nèi)代謝也具有重要的調(diào)控作用。我們的前期研究也表明，CSFV感染不但可以誘導細胞自噬的發(fā)生，而且可以利用自噬促進CSFV的復(fù)制與病毒粒子的釋

4、放。在此基礎(chǔ)上，本論文一方面通過對CSFV與細胞線粒體自噬相互關(guān)系的研究，揭示線粒體自噬對CSFV復(fù)制以及細胞凋亡的影響。另一方面還通過對CSFV感染豬脾臟組織內(nèi)自噬與凋亡相互關(guān)系的分析，揭示自噬在脾臟細胞死亡中發(fā)揮的作用。此外，本論文利用代謝組學技術(shù)對CSFV感染的PK-15與3D4/2細胞代謝物的多參數(shù)動態(tài)變化進行檢測，分析了糖代謝、核苷酸代謝、氨基酸代謝與脂肪酸代謝在CSFV復(fù)制與天然免疫逃逸中的作用。
　　CSFV誘導線粒

5、體自噬抑制細胞凋亡的機制研究。病毒感染過程中可將其蛋白通過線粒體定位序列靶向錨定于細胞線粒體導致線粒體損傷，同時病毒可特異性的誘導細胞線粒體自噬清除損傷的線粒體并恢復(fù)線粒體穩(wěn)態(tài)。為了揭示CSFV感染誘導細胞線粒體自噬以及線粒體自噬在CSFV感染中的作用機制，我們選取 CSFV易感的PK-15細胞與豬固有免疫細胞-肺泡巨噬細胞3D4/2作為CSFV感染模型。首先利用Weston blot對細胞感染CSFV后不同時間線粒體的數(shù)量進行了分析。

6、結(jié)果顯示，細胞感染CSFV后36 h線粒體的數(shù)量開始減少。為了確認CSFV感染誘導的細胞線粒體減少與自噬發(fā)生的相關(guān)性，我們分別應(yīng)用自噬抑制劑3-methlyadenine（3-MA）與溶酶體遞呈抑制劑Bafilomycin A1（BafA1）對CSFV感染PK-15與3D4/2細胞的自噬發(fā)生與溶酶體遞呈過程進行阻斷，然后利用Weston blot檢測細胞內(nèi)線粒體數(shù)量的變化。結(jié)果表明，3-MA與BafA1均可阻止CSFV感染細胞的線粒體數(shù)

7、量減少，這提示CSFV感染促進細胞內(nèi)線粒體自噬的發(fā)生。為了進一步證實CSFV感染誘導細胞線粒體自噬的發(fā)生，我們利用透射電鏡技術(shù)對CSFV感染PK-15與3D4/2細胞的線粒體形態(tài)變化進行了觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CSFV感染可導致細胞內(nèi)出現(xiàn)大量膜狀結(jié)構(gòu)包裹的線粒體，表明CSFV感染可誘導細胞線粒體自噬樣結(jié)構(gòu)的形成。
　　為探討CSFV感染誘導細胞線粒體自噬發(fā)生的機制，我們又對CSFV感染PK-15與3D4/2細胞的線粒體進行了分離純化，再

8、通過Weston blot技術(shù)對純化線粒體的PINK1與Parkin蛋白分子富集程度進行了檢測。結(jié)果表明，CSFV感染促進了細胞PINK1與Parkin分子的線粒體移位。為了確定CSFV感染增強細胞Parkin分子的泛素化連接酶活性作用，我們利用免疫沉淀與Westonbot對CSFV感染PK-15與3D4/2細胞內(nèi)Parkin下游分子-MFN2蛋白的泛素化水平進行了檢測。結(jié)果證明，CSFV感染誘導的細胞內(nèi)MFN2蛋白減少與Parkin分

9、子對MFN2蛋白的泛素降解是密切相關(guān)的。在證明了CSFV感染誘導細胞PINK1-Parkin通路激活的基礎(chǔ)上，為了進一步驗證 Parkin分子的線粒體移位與線粒體自噬的直接聯(lián)系，我們利用激光共聚焦技術(shù)對CSFV感染的PK-15與3D4/2細胞的Parkin、GFP-LC3、線粒體三者之間的共定位情況進行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CSFV感染可導致細胞內(nèi)Parkin標記的線粒體與自噬體發(fā)生融合。為了進一步證明CSFV感染誘導細胞線粒體完全自噬的發(fā)

10、生，我們利用mito-mRFP-GFP線粒體自噬雙熒光報告系統(tǒng)對CSFV感染PK-15與3D4/2細胞線粒體的溶酶體遞呈情況進行了分析。結(jié)果顯示，CSFV感染導致細胞內(nèi)線粒體呈現(xiàn)更多RFP熒光，證明了CSFV感染可引起溶酶體對線粒體的降解。另外，為了確認CSFV感染PK-15與3D4/2細胞線粒體自噬體與溶酶體的融合，我們利用激光共聚焦技術(shù)對細胞內(nèi)GFP-LC3、線粒體、溶酶體三者的共定位情況進行了觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CSFV感染細胞內(nèi)與G

11、FP-LC3熒光斑點融合的線粒體同時可以與溶酶體發(fā)生融合，說明CSFV感染誘導細胞線粒體自噬溶酶體的產(chǎn)生。
　　在證明了CSFV感染誘導PK-15與3D4/2細胞線粒體完全自噬發(fā)生的基礎(chǔ)上，本論文進一步研究了CSFV感染細胞內(nèi)線粒體活動的變化。我們利用共聚焦顯微鏡對CSFV感染PK-15與3D4/2細胞的線粒體形態(tài)以及Drp1分子的線粒體移位情況進行觀察，證明了CSFV感染可導致細胞內(nèi)線粒體分裂的產(chǎn)生。為了進一步研究線粒體分裂與線

12、粒體自噬對CSFV復(fù)制的影響，我們通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)PK-15和3D4/2細胞Drp1和Parkin基因的功能，應(yīng)用Weston blot、qPCR與間接免疫熒光技術(shù)對CSFV的Npro蛋白表達水平、病毒拷貝數(shù)與病毒滴度進行了測定。結(jié)果證明，下調(diào)細胞Drp1與Parkin基因功能可顯著降低CSFV的Npro蛋白表達、病毒拷貝數(shù)與病毒滴度，表明CSFV可利用感染誘導的細胞線粒體分裂與線粒體自噬促進病毒復(fù)制。為了闡明CSFV感染誘導細胞

13、線粒體分裂與線粒體自噬促進病毒復(fù)制的機制，我們對Drp1與Parkin基因功能下調(diào)的CSFV感染PK-15和3D4/2細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和PARP的表達水平進行檢測，并應(yīng)用流式細胞技術(shù)對細胞凋亡情況進行了分析。結(jié)果表明，抑制CSFV感染細胞的線粒體分裂與線粒體自噬可促進細胞凋亡。
　　CSFV感染導致豬脾臟T區(qū)部分細胞自噬性死亡。脾臟作為機體重要的外周免疫器官，有多種類群的巨噬細胞與淋巴細胞，并且是CSFV體內(nèi)復(fù)

14、制的重要場所。據(jù)此，本研究選取豬的脾臟作為靶器官對CSFV體內(nèi)感染過程中病毒、自噬與凋亡的相互關(guān)系進行研究。首先我們應(yīng)用免疫組化技術(shù)對脾臟組織中CSFV的E2蛋白染色檢測CSFV對脾臟細胞的感染情況。結(jié)果顯示，CSFV感染豬的脾臟內(nèi)大部分細胞呈現(xiàn)陽性。為研究CSF發(fā)生過程中脾臟組織自噬水平的變化，我們利用Weston blot對脾臟組織細胞LC3-II與SQSTM1/p62的表達情況進行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CSFV感染豬脾臟組織的LC3-

15、I向LC3-II的轉(zhuǎn)化與SQSTM1/p62的降解增強，提示CSFV感染導致豬脾臟組織自噬水平增加。同時，我們還通過Weston blot對脾臟組織自噬相關(guān)蛋白ATG5與BECN1的表達水平進行了檢測。結(jié)果表明，CSFV感染可促進脾臟組織ATG5與BECN1的表達，進一步驗證了CSFV感染引起脾臟組織自噬途徑的活化。為了檢測CSFV感染誘導脾臟組織中自噬陽性細胞的分布情況，我們應(yīng)用免疫組化方法對脾臟組織的LC3-II分子陽性反應(yīng)進行了檢

16、測。結(jié)果顯示，CSFV感染豬脾臟組織中的自噬陽性細胞主要集中于脾小體周圍。
　　在此基礎(chǔ)上，我們又通過流氏細胞術(shù)對CSFV感染豬脾臟組織中的細胞凋亡情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)CSFV感染可顯著促進脾臟組織的細胞凋亡。為了再次確認CSFV感染與脾臟細胞凋亡的關(guān)系，我們對CSFV感染豬脾臟組織的凋亡標志性蛋白進行了檢測。結(jié)果顯示，CSFV感染引起豬脾臟組織活化形式的caspase-8、caspase-9、caspase-3和PARP的表達增加

17、，提示CSFV感染導致豬脾臟組織凋亡信號活化。為了解CSFV感染誘導的凋亡陽性細胞在脾臟組織的分布情況，我們應(yīng)用TUNEL標記法對CSFV感染豬脾臟內(nèi)的凋亡陽性細胞進行了檢測。結(jié)果顯示，CSFV感染可導致脾臟內(nèi)凋亡陽性細胞同樣分布在脾小體周圍，提示CSFV感染豬脾臟組織內(nèi)凋亡與自噬之間的密切關(guān)系。
　　為了進一步研究CSFV感染豬脾臟組織內(nèi)自噬與凋亡的相互關(guān)系，我們應(yīng)用激光共聚焦技術(shù)對CSFV感染豬脾臟組織細胞LC3-II與TUN

18、EL的共定位情況進行了分析。結(jié)果顯示，CSFV感染導致豬脾臟組織內(nèi)部分LC3-II陽性細胞（約40％）同時呈現(xiàn)TUNEL陽性，并且這些雙陽性細胞主要分布在脾小體周圍。以上結(jié)果提示，自噬在CSF發(fā)生中可能導致脾臟組織細胞的死亡，并介導T區(qū)淋巴細胞的減少。為了闡明CSFV感染脾臟組織內(nèi)自噬、凋亡與病毒感染的關(guān)系，我們利用激光共聚焦技術(shù)對CSFVE2蛋白與LC3-II分子、CSFV E2蛋白與TUNEL分子的共定位情況分別進行了分析。結(jié)果表明

19、，CSFV感染豬脾臟組織內(nèi)大部分的自噬陽性細胞被CSFV感染，與之不同的是凋亡細胞很少被CSFV感染。值得注意的是，少部分未被CSFV感染的細胞也呈現(xiàn)自噬陽性。
　　CSFV感染的代謝組學研究。病毒感染可引起細胞內(nèi)某些代謝物質(zhì)的變化并與疾病的發(fā)生有關(guān)，但有關(guān)CSFV感染與細胞內(nèi)的代謝物質(zhì)變化關(guān)系的研究未見報道。本論文利用代謝組學技術(shù)對CSFV感染的PK-15與3D4/2細胞代謝物質(zhì)變化情況進行了檢測分析。結(jié)果顯示，在糖代謝方面，C

20、SFV感染導致PK-15細胞糖酵解途徑中的葡萄糖、果糖-6-磷酸、甘油醛-3-磷酸含量減少，也導致3D4/2細胞糖酵解途徑中甘油醛-3-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸含量減少，表明CSFV感染導致細胞糖酵解途徑中代謝物的利用率增加，提示CSFV感染促進細胞糖酵解的發(fā)生。同時，CSFV感染促進PK-15細胞三羧酸循環(huán)中檸檬酸、異檸檬酸、α-酮戊二酸的產(chǎn)生，卻抑制3D4/2細胞這3種物質(zhì)的產(chǎn)生，提示CSFV感染激活PK-15細胞三羧酸循環(huán)為

21、病毒復(fù)制提供充足的能量，相反CSFV感染可能通過抑制3D4/2細胞三羧酸循環(huán)限制細胞免疫功能發(fā)揮需要的能量。
　　在核苷酸代謝方面，CSFV感染PK-15細胞5-磷酸核酮糖含量減少，表明CSFV感染導致PK-15細胞磷酸戊糖途徑中代謝物的利用率增加，提示CSFV感染激活PK-15細胞磷酸戊糖途徑并促進病毒RNA合成需要的戊糖產(chǎn)生。CSFV感染PK-15細胞葡萄糖醛酸、木糖醇、木酮糖、阿糖醇的含量均減少，表明CSFV感染導致PK-1

22、5細胞葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)化途徑中代謝物的利用率增加，提示CSFV感染同樣可激活PK-15細胞葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)化途徑并促進戊糖產(chǎn)生。同時，CSFV感染PK-15細胞肌苷、肌苷酸、鳥嘌呤含量均減少，提示CSFV感染PK-15細胞病毒RNA合成活動對堿基的消耗增加。另外，CSFV感染3D4/2細胞5-單磷酸尿嘧啶的含量減少，也提示CSFV感染3D4/2細胞內(nèi)病毒RNA合成活動對堿基的消耗增加。
　　在氨基酸代謝方面，CSFV感染抑制PK-15細胞

23、丙氨酸、天冬氨酸與谷氨酸降解途徑、丙氨酸與天冬氨酸代謝途徑、甘氨酸、絲氨酸與蘇氨酸代謝途徑、纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸降解途徑，提示CSFV感染抑制PK-15細胞的蛋白合成。與其相反的是CSFV感染激活3D4/2細胞纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸降解途徑、丙氨酸、天冬氨酸與谷氨酸降解途徑、β-丙氨酸代謝途徑、?；撬崤c亞?；撬岽x途徑，提示CSFV感染促進3D4/2細胞的蛋白合成。
　　在脂肪酸代謝方面，CSFV感染PK-15細胞的棕櫚烯酸