NR2A和NR2B逆向調(diào)控神經(jīng)元死亡及其分子機(jī)制研究.pdf

1、腦卒中是危害人類生命與健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病，迄今為止，唯一有效的治療方法就是溶栓療法，經(jīng)過(guò)rt-PA治療后有32％的病人有不同程度的好轉(zhuǎn)，但必須在發(fā)作的3小時(shí)內(nèi)使用，由于治療窗和禁忌癥的限制，只有5％的病人可使用該療法。因此，進(jìn)一步研究腦卒中的分子機(jī)制，研制開(kāi)發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗腦卒中新藥意義重大。 N-甲基-D-天門(mén)冬氨酸(NMDA)受體是一種門(mén)控離子通道復(fù)合物，作為興奮性氨基酸受體之一，主要分布于大腦皮層、海馬、紋狀體等部

2、位，是興奮性氨基酸遞質(zhì)傳遞的重要基礎(chǔ)，同時(shí)是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能正常的關(guān)鍵因素。NMDA受體介導(dǎo)的神經(jīng)興奮性毒性在缺血性腦損傷中起關(guān)鍵作用。NMDA受體拮抗劑的臨床研究已進(jìn)行了許多年，但其結(jié)果不盡如人意，目前所研發(fā)的NMDA受體拮抗劑主要分為以下三類：競(jìng)爭(zhēng)性受體拮抗劑、離子通道阻斷劑和甘氨酸位點(diǎn)拮抗劑。迄今還沒(méi)有哪一類藥物能成功地治療腦中風(fēng)和腦損傷患者，所有臨床研究使用的NMDA受體拮抗劑均因療效不確切或引起幻覺(jué)、昏迷、精神異常等嚴(yán)重的

3、不良反應(yīng)而被停用(如：selfotel、eliprodil、licostinel、lanicemine、UK224-0455、SM231900等)。有研究者認(rèn)為，NMDA受體拮抗劑阻斷NMDA受體興奮性毒性作用的同時(shí)也阻斷了NMDA受體的正常生理功能。既然完全阻斷NMDA受體不能達(dá)到有效地治療效果，那么就需要阻斷那些有害的NMDA受體。首先就要求我們區(qū)分損傷后哪些NMDA受體的激活后會(huì)引起有害作用，哪些會(huì)行使保護(hù)功能。由此引發(fā)了近年來(lái)關(guān)

4、于NMDA受體的幾個(gè)研究熱點(diǎn)：突觸內(nèi)外NMDA受體的研究、NR2A和NR2B亞型的研究和PSD-95與NR2B偶聯(lián)的研究。本部分的研究目的是：研究NR2A和NR2B亞型是否在調(diào)控神經(jīng)元死亡中起著不同的作用，并對(duì)其分子機(jī)制作初步探討。如果NR2B或NR2A真的與死亡或存活特異的聯(lián)系在一起，那么將是一個(gè)很好的研究靶點(diǎn)。 第一章 NR2A和NR2B亞型逆向調(diào)控神經(jīng)元死亡 目的：研究NR2A和NR2B亞基對(duì)神經(jīng)元死亡的調(diào)控作用，

5、并對(duì)其機(jī)理作初步探討。 方法：培養(yǎng)至11天的皮層神經(jīng)元，分別給予谷氨酸、谷氨酸/NVP-AAM007和谷氨酸/Ro25-6981孵育24小時(shí)，觀察LDH露出率、NO含量的變化；培養(yǎng)至11天的皮層神經(jīng)元，分別給予谷氨酸、谷氨酸/NVP-AAM007和谷氨酸/Ro25-6981孵育1小時(shí)，觀察NOS活性的變化；培養(yǎng)至10天的皮層神經(jīng)元，分別給予NVP-AAM007和Ro25-6981孵育24小時(shí)，觀察NOS表達(dá)的影響；培養(yǎng)至10天的

6、皮層神經(jīng)元，給予谷氨酸及不同濃度的7-NI，觀察LDH漏出率的變化。 結(jié)果：NVP-AAM007可增加由谷氨酸引起的LDH漏出率、NO含量和NOS活性的增加，Ro25-6981的作用則相反；NVP-AAM007和Ro25-6981對(duì)NOS表達(dá)沒(méi)有影響；7-NI可阻止由谷氨酸引起的LDH漏出率增加。 結(jié)論：NR2A和NR2B亞基通過(guò)調(diào)節(jié)NOS活性來(lái)影響谷氨酸興奮性毒性作用。 第二章 NR2B在沙土鼠全腦缺血模型所致

7、CA1神經(jīng)元死亡中的作用 目的：研究NR2B對(duì)在沙土鼠全腦缺血模型所致神經(jīng)元死亡中的作用。 方法：在沙土鼠全腦缺血再灌注模型，給予MN2B拮抗劑Ro25-6981和7-NI，通過(guò)NeuN染色、結(jié)晶紫染色和Fluoro-Jade染色法來(lái)觀察對(duì)沙土鼠CA1神經(jīng)元死亡的影響。 結(jié)果：3種免疫組化方法均表明R025-6981和7-NI可對(duì)抗全腦缺血所致CA1區(qū)神經(jīng)元死亡。 結(jié)論：腦缺血時(shí)，NR2B可能通過(guò)調(diào)控nN

8、OS活性來(lái)影響CA1區(qū)細(xì)胞的死亡。 第三章基于NR2B/PSD95的治療策略研究 目的：采用藥理學(xué)和分子生物學(xué)手段，研究在神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)NR2B羧基端序列多肽是否能抑制興奮性毒性神經(jīng)元損傷。 方法：直接合成引物進(jìn)行配對(duì)PCR或從小鼠海馬基因組DNA上進(jìn)行擴(kuò)增獲得目的基因，將獲得的目的基因連接到Stratagene公司的AAV-IRES-GFP質(zhì)粒上，使用AAV Helper-Free System來(lái)構(gòu)建能表達(dá)NR2

9、B羧基端33個(gè)和200個(gè)氨基酸多肽的重組AAV病毒(AAV-33C-IRES-GFP and AAV-200C-IRES-GFP)，應(yīng)用重組病毒感染原代神經(jīng)元，觀察其是否能阻斷由谷氨酸引起的神經(jīng)元損傷。 結(jié)果：形態(tài)學(xué)觀察表明，重組病毒AAV-33C-IRES-GFP and AAV-200C-IRES-GFP感染的神經(jīng)元在谷氨酸損傷后，神經(jīng)元形態(tài)良好，突起清晰可見(jiàn)；而AAV-GFP感染的神經(jīng)元在谷氨酸損傷后，細(xì)胞狀態(tài)差，突起斷裂