NG2蛋白多糖在LPS誘導(dǎo)的腎小球炎癥及系膜細(xì)胞增殖中的作用.pdf

1、第一部分 NG2蛋白多糖在腎小球中的表達(dá)及定位
　　目的:觀察大鼠乳鼠腎組織中NG2蛋白多糖的表達(dá)及其在腎小球的定位,對(duì)三種腎小球固有細(xì)胞系進(jìn)行檢測(cè),明確NG2在腎小球三種固有細(xì)胞中的具體表達(dá)情況。
　　方法:選擇出生1天的Wistar大鼠乳鼠,將其腎組織進(jìn)行固定、包埋后制成石蠟切片,免疫組化檢測(cè)觀察NG2在大鼠乳鼠腎組織的分布,對(duì)腎小球中NG2的表達(dá)進(jìn)行定位。以RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)條件永生化小鼠足細(xì)胞,DMEM培養(yǎng)基

2、培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞,DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠內(nèi)皮細(xì)胞。間接免疫熒光染色共聚焦顯微鏡下觀察三種腎小球固有細(xì)胞中NG2蛋白的表達(dá)情況。以RT-PCR法檢測(cè)足細(xì)胞、系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中NG2 mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:NG2蛋白在腎組織中有陽(yáng)性表達(dá),在腎小球中主要定位于系膜細(xì)胞及其周圍系膜區(qū)。在系膜細(xì)胞中NG2蛋白呈陽(yáng)性表達(dá),NG2均勻分布在系膜細(xì)胞胞膜上,而在細(xì)胞核上無(wú)表達(dá);NG2蛋白在足細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中均無(wú)陽(yáng)性表達(dá)。RT-PC

3、R從mRNA水平證實(shí)了在三種腎小球固有細(xì)胞中,NG2僅在系膜細(xì)胞中表達(dá)。
　　結(jié)論:腎小球中NG2表達(dá)于間葉組織來(lái)源的腎小球系膜細(xì)胞,在系膜細(xì)胞及其周圍的系膜區(qū)均有表達(dá),而在另外兩種腎小球固有細(xì)胞中無(wú)表達(dá),提示腎小球中NG2由系膜細(xì)胞分泌,并向周圍系膜基質(zhì)中釋放。
　　第二部分 LPS刺激后大鼠腎小球中NG2蛋白多糖和炎癥因子的表達(dá)變化
　　目的:觀察脂多糖(LPS)刺激后大鼠乳鼠腎小球中NG2蛋白多糖的表達(dá)及促炎因子

4、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的表達(dá)變化,初步探討NG2與腎小球炎癥反應(yīng)之間的關(guān)系。
　　方法:選擇出生1天的Wistar大鼠乳鼠30只,分為3組:對(duì)照組、LPS組和LPS+Dex組,分別腹腔注射生理鹽水、LPS和LPS+Dexamethasone。12小時(shí)后,取其一側(cè)腎組織進(jìn)行固定、包埋后制成石蠟切片,免疫組化檢測(cè)NG2在腎小球中的表達(dá)變化。另一側(cè)腎組織篩網(wǎng)法分離腎小球,提取腎小球mRNA和蛋白質(zhì)

5、,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NG2、TNF-α和IL-1β mRNA的表達(dá),ELISA檢測(cè)腎小球中NG2、TNF-α和IL-1β蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:NG2免疫組化結(jié)果顯示,NG2蛋白在腎小球系膜細(xì)胞及周圍基質(zhì)中表達(dá),與對(duì)照組相比,LPS刺激后NG2蛋白表達(dá)明顯增多;LPS刺激并與Dexamethasone干預(yù)后NG2蛋白表達(dá)較 LPS組減少。分離的腎小球提取RNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,LPS刺激后腎小球中NG2、TNF-α

6、和IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)水平均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);LPS刺激并與Dexamethasone干預(yù)后腎小球中NG2、TNF-α和IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)水平均較LPS組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。分離的腎小球提取蛋白,ELISA結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,LPS刺激后RMC中NG2、TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)水平均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);LPS刺激并與Dexamethasone

7、干預(yù)后RMC中NG2、TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)水平較LPS組均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　結(jié)論:腎小球系膜細(xì)胞NG2高表達(dá)與腎小球炎癥密切相關(guān),NG2可誘導(dǎo)促炎因子TNF-α和IL-1β高表達(dá),通過(guò)TNF-α和IL-1β介導(dǎo)腎小球炎癥反應(yīng)。
　　第三部分 NG2蛋白多糖在腎小球炎癥與系膜細(xì)胞增殖中的作用
　　目的:觀察LPS刺激后NG2蛋白多糖和促炎因子TNF-α和IL-1β在大鼠系膜細(xì)胞(RM

8、C)的表達(dá)變化,以及RMC的增殖情況;NG2-siRNA轉(zhuǎn)染RMC下調(diào)NG2表達(dá)后,觀察促炎因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)變化及RMC增殖的變化,探討NG2與腎小球炎癥反應(yīng)及系膜細(xì)胞增殖之間的關(guān)系。
　　方法:(1)體外培養(yǎng)RMC,將細(xì)胞分為3組:對(duì)照組、LPS組和LPS+Dex組,干預(yù)8小時(shí)后,間接免疫熒光染色觀察NG2蛋白的表達(dá),實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)RMC中NG2、TNF-α和IL-1β mRNA的表達(dá),ElISA檢測(cè)RM

9、C培養(yǎng)上清液中NG2、TNF-α和IL-1β,MTT檢測(cè)RMC增殖情況。(2)設(shè)計(jì)及合成NG2-siRNA,用脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的RMC,24小時(shí)后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染標(biāo)志Cy3的表達(dá);48小時(shí)后PCR檢測(cè)NG2的干擾效率。(3)將細(xì)胞分為3組:正常對(duì)照組、LPS干預(yù)組和LPS干預(yù)+轉(zhuǎn)染NG2-siRNA組。NG2-siRNA轉(zhuǎn)染及LPS干預(yù)8小時(shí)后,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)RMC中NG2、TNF-α和IL-1βmRNA的表達(dá),El

10、ISA檢測(cè)RMC培養(yǎng)上清液中NG2、TNF-α和IL-1β,MTT檢測(cè)RMC增殖情況。
　　結(jié)果:(1)LPS刺激RMC8小時(shí)后免疫熒光結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比 LPS組中NG2蛋白表達(dá)明顯增多,且分布均勻。LPS+Dex組NG2蛋白表達(dá)較LPS組減少,但仍多于對(duì)照組。(2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和ELISA結(jié)果顯示,LPS刺激8小時(shí)后RMC中NG2、TNF-α、IL-1β mRNA和RMC培養(yǎng)上清液中NG2、TNF-α、IL-1β蛋白

11、表達(dá)水平均升高,RMC增殖效率上升,與對(duì)照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Dexamethasone干預(yù)可部分逆轉(zhuǎn)上述反應(yīng)。(3) NG2-siRNA轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,Cy3呈強(qiáng)熒光表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組及陰性siRNA轉(zhuǎn)染組相比,NG2-siRNA轉(zhuǎn)染組NG2表達(dá)顯著下降,達(dá)到下調(diào)NG2表達(dá)的效果。(4)LPS刺激RMC8小時(shí)后,與對(duì)照組相比,RMC中NG2、TNF-α、IL-1β mRNA和RMC