鼻咽癌組織中磷酸果糖激酶1的表達及RNA干擾靶向沉默磷酸果糖激酶1對鼻咽癌細胞株CNE2生物學(xué)特性的影響.pdf

1、本文分兩個部分進行探討：
　　第一部分:鼻咽癌組織中磷酸果糖激酶1的表達及其酶活性檢測
　　目的：檢測鼻咽部正常組織、癌組織中糖酵解途徑關(guān)鍵限速酶-磷酸果糖激酶i(phosphofructokinasel,PFK1)的mRNA和蛋白表達水平及其酶活性，分析磷酸果糖激酶1與鼻咽癌生物學(xué)特性的關(guān)系。
　　方法：采用病例-對照設(shè)計的方法，鼻咽癌組織活檢標本來自41位鼻咽癌的患者，對照組活檢標本來自20位鼻咽部慢性炎癥的患者鼻

2、咽部組織，采取實時定量PCR(RT-PCR)檢查PFKlmRNA的表達水平，采取免疫印跡法（Western-blot)檢測PFK1蛋白的表達；酶學(xué)分析的方法檢測PFK1酶活性。
　　結(jié)果：在鼻咽部的活檢標本中，①鼻咽癌組中的PFK1mRNA表達水平、蛋白表達水平及其酶活性均明顯高于鼻咽部慢性炎性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01)，②在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組中PFK1 mRNA表達水平、蛋白表達水平及其酶活性均明顯高于無伴淋巴結(jié)

3、轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01)。
　　結(jié)論：PFK1與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可能作為鼻咽癌的分子標志物之一，特異性抑制PFK1有可能成為治療鼻咽癌的新策略。
　　第二部分:RNA干擾靶向沉默磷酸果糖激酶1的表達對鼻咽癌細胞株CNE2生物學(xué)特性的影響
　　目的：惡性腫瘤細胞糖酵解途徑增強，而磷酸果糖激1(phosphofructokinase1,PFK1)是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，本研究通過構(gòu)建shR

4、NA-PFK1質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE2細胞,分析鼻咽癌細胞生物學(xué)特性的變化。
　　方法：構(gòu)建4條s_A-PFK1質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒至鼻咽癌CNE2細胞中,采用實時熒光定量PCR(real time quantitative PCR，RT-PCR)檢測不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后PFK1mRNA的表達變化，將抑制效率最高的shRNA-PFK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE2細胞,RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染前后PFK1mRNA表達的變化，免疫印跡法（Western-blot

5、)檢測PFK1蛋白表達的變化，酶學(xué)分析的方法檢測PFK1酶活性的變化，MTT法檢測轉(zhuǎn)染后細胞增殖能力的變化,流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染后細胞凋亡變化，細胞劃痕試驗檢測轉(zhuǎn)染后細胞體外遷移能力的變化，Transwell細胞侵襲試驗檢測轉(zhuǎn)染后細胞體外侵襲能力的變化。
　　結(jié)果：4條shRNA-PFK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE2細胞后，質(zhì)粒sh-H-PFK1-507的f值較其余3條質(zhì)粒及空白對照組、質(zhì)粒對照組小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01),有抑

6、制作用,且抑制效率最高。實驗組CNE2細胞在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒sh-H-PFK1-507后PFK1 mRNA表達量與空白對照組、質(zhì)粒對照組相比顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05)，PFK1蛋白表達量與其他兩組相比顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05)，PFK1酶活性與其他兩組相比顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05)。實驗組在24h、36h、48h、72h的吸光度值明顯低于其他兩組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P〈0.05)，實驗

7、組細胞增殖能力收到抑制。實驗組與空白對照組、質(zhì)粒對照組相比凋亡比例明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P〈0.01)。實驗組細胞體外遷移能力明顯低于空白對照組與質(zhì)粒對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P〈0.01)。實驗組細胞體外侵襲能力明顯低于空白對照組與質(zhì)粒對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P〈0.01)。
　　結(jié)論：shRNA-PFK1通過抑制鼻咽癌細胞PFK1的表達，進而抑制鼻咽癌細胞增殖能力、體外遷移能力和侵襲能力并促進細胞凋亡，可能成為治療