兔脂肪來源干細胞改善靜脈淤血皮瓣模型微循環(huán)功能的實驗研究.pdf

1、前言
　　靜脈淤血是皮瓣移植手術的常見并發(fā)癥，如不及時糾正，將會發(fā)展為靜脈危象狀態(tài)，最終造成皮瓣壞死。多年來，皮瓣靜脈危象的防治一直是整形外科的棘手問題。皮瓣靜脈淤血是由于皮瓣的靜脈血液回流受阻，使血液淤積于小靜脈和毛細血管內，引起皮瓣外觀腫脹、呈紫色的臨床現象。淤血的組織微循環(huán)內可能形成血栓，影響組織的營養(yǎng)，最后導致組織的壞死，造成手術失敗。近年來，術后局部應用肝素鹽水、水蛭素等抗凝劑，使用水蛭、機械水蛭，滾動按摩療法，拆線、放

2、血療法，高壓氧治療，局部應用生長因子及與干細胞共用等治療治療方法，這些方法都可以取得一定的效果，但也都存在著各自的局限性。隨著現代醫(yī)學的發(fā)展，干細胞在臨床上的應用越來越廣泛，也為臨床上移植術后皮瓣的成活帶來了新的希望。
　　干細胞技術目前正以其無可比擬的優(yōu)越性被應用于多種臨床研究及治療。脂肪間充質干細胞因具有來源廣泛、培養(yǎng)簡便、衰老水平低、免疫原性低等優(yōu)點而受到廣泛關注。脂肪間充質干細胞能夠分泌具有生物活性的bFGF、VEGF、H

3、GF、TGF-β等促進促進血管新生的因子，已有研究指出脂肪間充質干細胞具有很強的血管再生能力，在下肢缺血、心肌梗死及創(chuàng)傷愈合等過程中均能促進血管形成，將其應用于難治性創(chuàng)面也取得了良好的治療效果。在大鼠皮瓣移植模型中給予脂肪間充質干細胞治療能夠促進血管新生，改善局部血供，減少皮瓣的壞死，但脂肪間充質干細胞對改善靜脈淤血皮瓣微循環(huán)功能的作用機制還需繼續(xù)深入研究。
　　本研究擬分離兔脂肪間充質干細胞，同時建立兔耳靜脈淤血皮瓣模型，觀察應

4、用脂肪間充質干細胞促進靜脈淤血皮瓣成活的效果以及其作用機制，探討脂肪間充質干細胞在臨床上預防和治療皮瓣靜脈淤血的應用前景。
　　實驗方法
　　1、兔脂肪干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定細胞表面標記
　　2、兔脂肪干細胞體外向脂肪細胞及成骨細胞的分化誘導
　　3、建立兔耳靜脈淤血皮瓣模型
　　4、兔脂肪干細胞的CM-Dil標記
　　5、皮瓣組織DAPI染色
　　6、實驗組與對照組皮瓣成活面積測定
　

5、　7、HE染色觀察各組皮瓣組織的病理學改變
　　8、皮瓣微血管數目測定
　　9、cd34免疫熒光檢測內皮標記物
　　10、RT-PCR檢測VEGF及bFGFmRNA的表達
　　11、Westernblot檢測VEGF及bFGF蛋白的表達
　　實驗結果
　　1、體外提取兔脂肪干細胞并進行傳代，第3代脂肪干細胞流式細胞儀檢測表面標記結果顯示:CD90、CD29、CD13表達為陽性，而CD31、CD34、C

6、D45表達為陰性;細胞生長曲線表明脂肪間充質干細胞在第4d進入對數生長期并于第6d達到生長高峰。
　　2、兔脂肪干細胞體外成脂誘導分化12d油紅O染色脂滴處呈紅色，成骨誘導分化21d茜素紅染色可見細胞形成典型的橘紅色鈣化結節(jié)。
　　3、皮瓣術后均出現滲血及腫脹，遠端形成淤血，邊緣壞死，顏色暗紅。鏡下觀察可見真皮內單核細胞及中性粒細胞黏附，毛細血管及微靜脈內存在大量的紅細胞聚集，微靜脈內發(fā)生血栓。
　　4、體外采用CM-

7、Dil標記脂肪間充質干細胞，將標記好的細胞置于熒光顯微鏡下觀察，顯示為紅色熒光，標記率達95％以上。
　　5、DAPI染色皮瓣皮下組織細胞置于熒光顯微鏡下觀察見藍染細胞，標記率達90％以上。
　　6、脂肪間充質干細胞皮下注射實驗組與對照組相比，靜脈淤血皮瓣的成活面積明顯增加。
　　7、對照組真皮內單核細胞及中性粒細胞黏附，毛細血管及微靜脈內存在大量的紅細胞聚集，微靜脈內發(fā)生血栓。而實驗組毛細血管及微靜脈內紅細胞聚集消散

8、，血栓程度明顯減輕。
　　8、實驗組皮下注射ADSCs的靜脈淤血皮瓣組織微血管數目顯著升高，差異具有統計學意義。
　　9、免疫熒光檢測CD34的表達與微血管數目檢測結果基本一致，即實驗組CD34的表達明顯高于對照組。
　　10、RT-PCR檢測bFGF及VEGFmRNA的表達，實驗組表達量升高，顯著高于對照組，差異具有統計學意義。
　　11、Westernblot檢測bFGF及VEGF蛋白的表達結果與mRNA基本