Livin反義寡核苷酸對人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7增殖和凋亡的影響.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)選取人乳腺癌細(xì)胞MCF-7為研究對象，針對人類Livin mRNA設(shè)計(jì)合成能特異性地阻抑Livin表達(dá)的反義寡核苷酸(antisense oligidexynucleotide，ASODN)，觀察ASODN抑制MCF-7細(xì)胞的體外增殖和Livin mRNA的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。為針對Livin基因的反義治療策略及臨床抗腫瘤藥物開發(fā)提供新的手段。 方法 設(shè)計(jì)合成特異性的Livin硫代磷酸ASODN及其對照錯(cuò)

2、義寡核苷酸(missense oligodeoxynucleotides，MSODN)，其中反義鏈(Antisense strand)是與LiVin mRNA翻譯起始區(qū)域20個(gè)堿基序列(包括起始密碼ATG)互補(bǔ)的反義寡核苷酸片段，錯(cuò)義鏈(Missense strand)與Livin mRNA無配對關(guān)系，且不與任何人類已知基因互補(bǔ)。根據(jù)作用藥物不同，分為ASODN作用組(處理藥物為ASODN)、MSODN作用組(處理藥物為MSODN)和R

3、PMI-1640作用組(處理藥物為單純無血清RPMI-1640)。上述藥物作用于人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，采用MTT法檢測Livin ASODN對MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用，RT-PCR檢測Livin mRNA的表達(dá)水平，電鏡、倒置顯微鏡、HE染色、流式細(xì)胞儀(FCM)以及吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)細(xì)胞染色法檢測細(xì)胞凋亡水平和形態(tài)學(xué)改變。 結(jié)果 1．與對照組相比ASODN對MCF-7細(xì)胞的增殖抑制呈濃度依賴性，其濃

4、度在2.5 μmol/L～10 μmol/L時(shí)具有顯著性，當(dāng)ASODN為10 μmol/L，作用MCF-7 48h時(shí)，抑制率最大為44.11﹪，IC<,50>= 3.44μmol/L。而當(dāng)ASODN達(dá)到20 μmol/L或作用72 h時(shí)，其抑制細(xì)胞增殖的作用不再增加，并有所減弱。MSODN在高濃度20 μmol/L時(shí)，對,MCF-7細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用，在2.5 μmol/L～10 μmol/L濃度區(qū)間僅有濃度依賴性輕度細(xì)胞毒作用的趨勢，

5、無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。 2．MCF-7細(xì)胞經(jīng)ASODN作用后，電鏡結(jié)果顯示：細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變：核染色質(zhì)固縮凝結(jié)，形成高密度電子斑塊；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張呈空泡狀；染色質(zhì)邊集；核裂解為高密度斑塊，周圍有質(zhì)膜包圍，形成凋亡小體。RPMI-1640組和MSODN組細(xì)胞胞膜完整，細(xì)胞表面較多細(xì)小突起，核漿比例大，細(xì)胞器豐富。 3．倒置顯微鏡觀察：細(xì)胞經(jīng)10μmol/L Livin ASODN作用48小時(shí)后，在倒置顯微鏡下觀察并拍照

6、發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化明顯：細(xì)胞由不規(guī)則星狀向圓形改變，細(xì)胞邊緣不整、出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落和漂浮細(xì)胞增多;細(xì)胞間接觸變松，界限變模糊，細(xì)胞間隙增大，增殖減慢。而RPMI-1640組和MSODN組細(xì)胞生長旺盛，輪廓清晰，呈梭形，貼壁生長良好，沒有明顯的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。 4．HE染色結(jié)果：RPMI-1640組和MSODN組細(xì)胞分布較密集，細(xì)胞呈星狀，扁平，體積較大，細(xì)胞均質(zhì)，胞漿深染，核膜、核仁輪廓明顯，染色深，多見核分裂相，細(xì)胞壁光滑

7、，折光性好；而ASODN組可見細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞見疏松，胞漿濃縮。 5．RT-PCR結(jié)果證實(shí)：10 μmol/L的Livin ASODN作用MCF-7細(xì)胞48h后可明顯降低Livin mRNA的表達(dá)，而MSODN組在相同濃度下無此作用。 6．流式細(xì)胞儀分析：與RPMI-1640組相比，ASODN組凋亡細(xì)胞增加了26.82﹪，而MSODN組沒有明顯的凋亡細(xì)胞增加。 7．AO/EB熒光染色顯示：AS