雌激素代謝差異性調(diào)節(jié)在不同多不飽和脂肪酸影響乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖中的作用研究.pdf

1、乳腺癌是世界范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤，嚴重威脅女性的生命與健康。隨著生活方式的變化，尤其是膳食結(jié)構(gòu)的日趨“西化”，包括中國在內(nèi)的一些發(fā)展中國家婦女乳腺癌的發(fā)病率逐年升高。研究表明，乳腺癌與膳食、營養(yǎng)因素，尤其與膳食脂肪攝入密切相關(guān)。盡管對膳食、脂肪酸與乳腺癌之間關(guān)系的研究已有大量報道，但人群研究由于各地膳食模式的不同、受試人群的差異性，以及研究質(zhì)量控制等因素，結(jié)果往往不盡相同。細胞和動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，不同種類的脂肪酸在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過

2、程中產(chǎn)生的影響各不相同，如n-6多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)和n-3 PUFA在乳腺癌形成過程中發(fā)揮的作用正好相反，前者可促進乳腺癌的發(fā)生和癌細胞的生長，而后者則有抗腫瘤及誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡的作用，但PUFA影響乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制尚不明了。
　　 乳腺癌作為一種激素依賴性腫瘤，雌激素在其發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，雌激素主要通過受體依賴途徑和非受體依賴途

3、徑促進乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。雌激素與細胞內(nèi)雌激素受體(estrogen receptor，ER)結(jié)合，通過線粒體或細胞核內(nèi)ER介導(dǎo)的信號通路促進細胞增殖、抑制細胞凋亡，影響乳腺癌的發(fā)生。在非受體依賴途徑中，雌激素通過其代謝產(chǎn)物導(dǎo)致細胞DNA損傷并誘發(fā)癌癥。由于ER陰性乳腺癌比ER陽性乳腺癌惡性度更高也更難治療，雌激素通過非受體途徑促進乳腺癌發(fā)生的機制研究更具有重要現(xiàn)實意義。
　　 芳香化酶(cytochrome P-45019，C

4、YP19)是雌激素生物合成的關(guān)鍵限速酶，其活性的改變直接影響內(nèi)源性雌激素的生成。雌激素經(jīng)過第一相和第二相代謝反應(yīng)，生成具有不同性質(zhì)的代謝產(chǎn)物。其中，經(jīng)過人類細胞色素P4501B1(cytochrome P-4501B1，CYP1B1)代謝生成的4-羥雌二醇(4-hydroxyestradiol，4-OH E2)被認為是雌激素通過非受體依賴途徑致癌過程中重要的內(nèi)源性致癌物。4-OH E2在體內(nèi)氧化還原過程中產(chǎn)生醌和半醌等自由基可與DNA共

5、價結(jié)合，引起DNA損傷。兒茶酚甲基轉(zhuǎn)移酶(catechol-O-methyl transferase，COMT)將4-OH E2甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)樗苄缘?-Meo E2排出體外，催化2-OH E2甲基化反應(yīng)生成具有抗癌活性的2-Meo E2，降低致癌的醌類物質(zhì)生成。因此，對雌激素代謝過程中關(guān)鍵酶的調(diào)控可能是影響雌激素通過非受體依賴途徑促進乳腺癌發(fā)生的重要因素，我們推測CYP1B1可能是其中一個重要的靶點。
　　 以往開展的關(guān)于脂肪酸

6、影響雌激素水平及其生物效應(yīng)的研究較少。有研究提示，PUFA對雌激素合成、代謝酶的表達可能存在不同的調(diào)節(jié)作用，然而該類研究只局限于PUFA代謝產(chǎn)物前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)/PGE3的生物效應(yīng)，因此脂肪酸通過雌激素途徑影響乳腺癌發(fā)生的機制仍不十分清楚。
　　 為了探討雌激素代謝調(diào)節(jié)在n-6/n-3PUFA促進/抑制乳腺癌細胞增殖的差異性作用，本研究選擇乳腺癌MDA-MB-231細胞(ER陰性)為研究

7、對象，采用CCK-8法、熒光實時定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR)、蛋白免疫印跡、siRNA干擾等實驗技術(shù)，觀察二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA，n-3 PUFA)和二十碳四烯酸(arachidonic acid，AA，n-6 PUFA)兩種不同PUFA對乳腺癌細胞增殖和雌激素代謝相關(guān)酶表達的影響，同時通過沉默CYP1B1基因，進一步研究上述兩種P

8、UFA對乳腺癌細胞增殖作用影響的變化，以探討雌激素代謝酶的差異性調(diào)節(jié)在不同PUFA影響乳腺癌細胞增殖中的作用。
　　 主要實驗結(jié)果和結(jié)論如下：
　　 1.以不同濃度(20、40、60、80和100μmol/L)EPA和AA處理雌激素受體陰性(ER-)乳腺癌MDA-MB-231細胞，CCK-8法檢測細胞增殖功能改變，發(fā)現(xiàn)EPA能有效抑制乳腺癌細胞生長，而AA顯著促進乳腺癌細胞生長，并呈顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系；
　　

9、2.一定劑量AA處理MDA-MB-231細胞能升高其雌激素代謝酶CYP19和CYP1B1mRNA表達，降低COMT mRNA表達，從而導(dǎo)致雌激素代謝相關(guān)致癌物生成增多；而相同劑量的EPA則降低MDA-MB-231細胞CYP19和CYPIBl mRNA表達，升高COMTmRNA表達。表明不同種類的PUFA對乳腺癌細胞雌激素代謝相關(guān)酶的基因表存在明顯差異性調(diào)節(jié)；
　　 3.MDA-MB-231乳腺癌細胞通過siRNA干擾技術(shù)有效沉默

10、CYP1B1表達24 h后，再經(jīng)PUFA處理24 h，結(jié)果顯示，siRNA轉(zhuǎn)染能顯著抑制CYP1B1 mRNA和蛋白表達(mRNA表達水平下降了80±3.67%，蛋白水平下降了85±2.58%，P<0.05)，而滅活雌激素代謝相關(guān)致癌物的酶COMT mRNA和蛋白表達水平均有明顯升高，其中經(jīng)EPA處理的細胞COMT表達升高最明顯。提示CYP1B1表達沉默能明顯上調(diào)COMT的表達，從而減少雌激素代謝相關(guān)致癌物的產(chǎn)生；
　　 4.C

11、YPB1表達沉默顯著抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖，細胞數(shù)量在轉(zhuǎn)染24h、36h和48h后分別降低了(30±6.76)%、(33±6.91)%和(35±5.87)%。CYP1B1正常表達的乳腺癌細胞經(jīng)EPA處理后增殖能力受到抑制，而AA則促進乳腺癌細胞的增殖；CYPB1表達沉默的乳腺癌細胞經(jīng)EPA處理后細胞數(shù)量不降反升，AA對乳腺癌細胞的增殖促進作用亦被削弱。表明CYP1B1表達沉默能顯著降低乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖

12、能力，且該基因的沉默逆轉(zhuǎn)EPA對乳腺癌細胞增殖的抑制作用，削弱了AA對乳腺癌細胞增殖的促進作用，提示EPA對MDA-MB-231細胞的增殖抑制作用是通過其影響CYP1B1的表達來實現(xiàn)的。
　　 綜上所述，本研究利用EPA和AA比較不同PUFA對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖作用的影響，分析雌激素代謝相關(guān)酶的表達，發(fā)現(xiàn)PUFA對乳腺癌細胞增殖的作用可能是通過差異性調(diào)節(jié)雌激素代謝酶CYP1B1的表達來實現(xiàn)。該項研究結(jié)果為進一步闡