人胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植潛能相關(guān)生物學(xué)特性與向多巴胺能神經(jīng)元分化的體外研究.pdf

1、研究背景: 帕金森病(PD)是以中腦黑質(zhì)紋狀體區(qū)多巴胺(DA)能神經(jīng)元進(jìn)行性變性為主要病理特征的一類中樞慢性退行性疾病。統(tǒng)計學(xué)資料顯示，在65歲以上老年人群中，PD的發(fā)病率以超過1％，已躍居為僅次子阿爾茨海默病嚴(yán)重威脅老年人健康的第二大殺手。臨床上主要表現(xiàn)為靜止性震顫、僵直、運(yùn)動遲緩和姿勢異常，晚期也將出現(xiàn)自主神經(jīng)功能紊亂、感覺障礙、精神異常和認(rèn)知障礙等非運(yùn)動性癥狀，給患者身心健康、家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。
　　 PD臨床運(yùn)

2、動功能障礙主要是由黑質(zhì)紋狀體通路中多巴胺的嚴(yán)重缺失而造成。目前藥物治療（左旋多巴）能有效恢復(fù)多巴胺水平，仍然是早期臨床治療的主旋律，但長期服用會造成嚴(yán)重的異動和精神障礙。外科手術(shù)（腦深部電刺激術(shù)）是晚期PD患者的主要治療選擇，雖然同樣能有效的控制癥狀，但手術(shù)費(fèi)用昂貴，在緩解疾病進(jìn)展方面也并沒有定論。
　　 近年來，細(xì)胞替代治療在退行性疾?。ㄈ?PD）治療逐漸展現(xiàn)出廣闊的前景。許多實(shí)驗(yàn)室和臨床研究也表明替代缺失的DA神經(jīng)元能改善P

3、D運(yùn)動癥狀，而干細(xì)胞由于其獨(dú)特的生物學(xué)特性逐漸成為了主要的細(xì)胞來源。干細(xì)胞體外可被誘導(dǎo)分化為DA神經(jīng)元的研究結(jié)果是細(xì)胞移植治療PD的理論基礎(chǔ)。胚胎干細(xì)胞(ESCs)是從發(fā)育早期胚囊內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離出來的一種未分化細(xì)胞，具有利于移植的各種優(yōu)勢，也能被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)或神經(jīng)前體細(xì)胞(NPCs)，隨后進(jìn)一步分化為DA神經(jīng)元。盡管如此，ESC在細(xì)胞移植方面的應(yīng)用面臨了巨大的限制，比如倫理束縛、易形成畸胎瘤。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs

4、)的發(fā)現(xiàn)雖曾一度帶來了新的希望，但是有研究表明iPSCs比其他類型多能干細(xì)胞有更高的基因畸變頻率，意味著更容易誘發(fā)腫瘤。因此，成體干細(xì)胞又重新成為了眾多研究者們的焦點(diǎn)。
　　 間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)可以自我更新，并可分化為不同的細(xì)胞譜系，這些均是干細(xì)胞移植治療的重要特征和先決條件，在生物醫(yī)學(xué)和組織工程中具有巨大的科研價值。迄今為止，盡管在許多不同的成體組織中發(fā)現(xiàn)了MSCs的存在，但大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室和臨床研究都是在闡述明確且充分的骨

5、髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)引導(dǎo)下進(jìn)行的。然而，由于骨髓的獲取過程有創(chuàng)易出現(xiàn)感染，以及其數(shù)量、分化能力和基因穩(wěn)定性均隨年齡的增大而下降。因此，在過去的幾十年，探索新干細(xì)胞來源的研究從未停止過。
　　 人類胎盤是在妊娠過程中的一個暫時性器官，由分別來自于胎兒和母體的胎膜層和底蛻膜層組成。在哺乳動物妊娠過程中，胎兒被作為半異體移植體，在妊娠期并不會受到母體免疫細(xì)胞的攻擊和排斥。胎盤在這個免疫耐受過程中起到重要作用，而發(fā)揮此作用的核心

6、部位是構(gòu)成母胎界面的母體蛻膜組織。有趣的是，越來越多的研究表明在足月胎盤的兩個組成部分里均含有大量的MSCs。其中，胎膜來源的MSCs(FMMSCs)由于來自胎兒而被推測具有多向分化潛能。確實(shí)，先前研究表明FMMSCs體外可被誘導(dǎo)分化為中胚層的心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞，內(nèi)胚層的胰島細(xì)胞、肝細(xì)胞以及外胚層的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞。而且這些結(jié)果同樣在體內(nèi)模型（心肌梗死和PD大鼠模型、糖尿病小鼠模型和脊髓損傷靈長類動物模型）中得

7、到了證實(shí)，進(jìn)一步說明了FMMSCs移植可產(chǎn)生功能性效用。相反，底蛻膜來源的MSCs(decidua basalis-derived MSCs，DBMSCs)很可能由于其母體來源而極少受到關(guān)注。In't Anker等首先描述了DBMSCs的分離和擴(kuò)增潛能。此外，另有研究表明DBMSCs的生長對缺氧和血清剝奪環(huán)境具有抵抗作用，可能為因局部缺血所造成的細(xì)胞凋亡提供更好的替代治療。但迄今為止，對于DBMSCs在遺傳穩(wěn)定性和增殖能力等方面的研究卻

8、鮮有，而這些特性與其移植潛能密切相關(guān)。
　　 與移植潛能相關(guān)的另一重要課題乃是移植后免疫排斥問題。免疫調(diào)節(jié)功能是MSCs用作細(xì)胞治療的一個極具吸引力的特征。重要的是，中樞神經(jīng)慢性炎性反應(yīng)是PD發(fā)生和發(fā)展的主要病理學(xué)基礎(chǔ)，許多動物實(shí)驗(yàn)表明緩解黑質(zhì)紋狀體區(qū)的炎癥反應(yīng)是減緩DA神經(jīng)元退化的有效手段。值得注意的是，炎癥雖然長期被認(rèn)為是大腦修復(fù)的阻礙，但同時也可通過分泌趨化因子促使干/祖細(xì)胞募集和遷移，這也恰巧構(gòu)成了干細(xì)胞移植治療PD的良

9、好微環(huán)境。相反，一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)等炎癥介質(zhì)可促使蛋白異常修飾而導(dǎo)致錯折疊和功能缺失，進(jìn)一步加劇神經(jīng)退變。MSCs借助于其特有的免疫調(diào)節(jié)功能，通過細(xì)胞接觸或分泌可溶性細(xì)胞因子對有害免疫炎性組分的調(diào)控抑制黑質(zhì)區(qū)微環(huán)境中的免疫活性，進(jìn)而對DA神經(jīng)元起到保護(hù)作用，為PD細(xì)胞移植治療打開了一扇新的窗戶。近年來，F(xiàn)MMSCs由于其低免疫原性（高表達(dá)HLA-G抗原、低表達(dá)HLA-Ⅱ抗原）吸引了眾多學(xué)者的目光。另外，通過分裂素或同種異

10、體細(xì)胞進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)試驗(yàn)證實(shí)FMMSCs具有免疫抑制作用。然而，在母胎免疫中發(fā)揮更重要作用的母體側(cè)蛻膜組織中的DBMSCs的免疫學(xué)特性尚未見報道。
　　 基于上述研究背景，試圖從胎盤母體側(cè)底蛻膜組織中分離并鑒定DBMSCs;從基因穩(wěn)定性、增殖能力和免疫學(xué)特性等角度分析其移植潛能;并進(jìn)一步研究其體外分化為DA神經(jīng)元的能力，評價其在將來PD治療方面的應(yīng)用前景。
　　 第一章人胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及鑒定

11、　　 目的:探索有效的DBMSCs體外分離、純化方法，建立穩(wěn)定的培養(yǎng)體系，并從表型和功能方面進(jìn)行鑒定。
　　 方法:通過酶消化法和密度梯度離心法從人足月胎盤（37-41孕周，男性胎兒）底蛻膜中獲取間充質(zhì)干細(xì)胞，采用限制性稀釋法純化獲取單細(xì)胞來源的克隆團(tuán)，倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)變化和生長特點(diǎn);流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及表面抗原(CD14，CD29，CD31，CD34，CD44，CD45，CD73，CD90，CD105，CD106)

12、的表達(dá);免疫細(xì)胞化學(xué)檢測內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記血管性血友病因子(vWF)、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記波形蛋白(vimentin)、成纖維細(xì)胞標(biāo)記D7-FIB、成骨細(xì)胞標(biāo)記堿性磷酸酶(ALP)、成軟骨細(xì)胞標(biāo)記Ⅱ型膠原蛋白(collagenⅡ)和脂肪細(xì)胞標(biāo)記周脂素(perilipin)的表達(dá)，顯微鏡下隨機(jī)選取10個視野(×200)計算陽性率。在特定的誘導(dǎo)條件下，使其向成骨、成脂、成軟骨方向分化，鑒定其多向分化潛能。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±SD）方式進(jìn)行統(tǒng)

13、計學(xué)描述。
　　 結(jié)果:人足月胎盤底蛻膜中分離的間充質(zhì)干細(xì)胞起初呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)，僅少量貼壁生長，7天后主要呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣長梭形，細(xì)胞生長緩慢，約在第14天形成克隆團(tuán)，每個克隆團(tuán)約100-200個細(xì)胞組成，大約3周后可達(dá)融合狀態(tài);傳代后細(xì)胞生長速度明顯加快，呈旋渦狀生長;經(jīng)限制性稀釋培養(yǎng)后，單細(xì)胞來源的DBMSCs克隆團(tuán)表現(xiàn)為均一的長梭形。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示:＞70％的細(xì)胞處于靜止期（G0/G1期），且這些細(xì)胞不表達(dá)造血細(xì)胞

14、標(biāo)記(CD14，CD34，CD45)和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記(CD31，CD106)，而典型的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記(CD29，CD44，CD73，CD90，CD105)呈陽性表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:僅少量DBMSCs表達(dá)公認(rèn)的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記vWF(4.0±1.2％)，而大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記vimentin（98.2±2.4％）和成纖維細(xì)胞D7-FIB（99.1±1.6％），在經(jīng)誘導(dǎo)前成骨細(xì)胞標(biāo)記ALP、成軟骨細(xì)胞標(biāo)記collagenⅡ和脂肪細(xì)

15、胞標(biāo)記perilipin均未見表達(dá)，而經(jīng)誘導(dǎo)后茜素紅染色、油紅O染色和Alcian blue染色均呈陽性表現(xiàn)。
　　 結(jié)論:人胎盤底蛻膜雖然來源于母體，同樣含有豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞，這種細(xì)胞具備一般MSCs基本特性，包括呈克隆樣貼壁生長、表達(dá)典型的MSCs表面標(biāo)記以及具有向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等中胚層分化潛能。
　　 第二章人胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植潛能相關(guān)生物學(xué)特性
　　 目的:通過對DBMSCs基因

16、穩(wěn)定性、增殖能力、免疫調(diào)節(jié)功能等生物學(xué)特性的深入探索，評價其在于細(xì)胞移植治療方面的應(yīng)用潛能。
　　 方法:將單細(xì)胞來源的DBMSCs分兩組，一組連續(xù)培養(yǎng)3周，血球計每周計數(shù)兩次，繪制生長曲線;另一組連續(xù)長期培養(yǎng)3月，獲取晚期代數(shù)細(xì)胞。染色體核型分析早、晚期代數(shù)DBMSCs的染色體核型變化。原子力顯微鏡(AFM)、透射電鏡(TEM)觀察晚期代數(shù)DBMSCs細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。密度梯度離心法體外分離人外周血單核細(xì)胞(PBM

17、Cs)，聯(lián)合DBMSCs建立混合淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)(MLCs)體系，在PBMCs經(jīng)植物凝血素(PHA)或同種異體PBMCs刺激后，CCK-8法分析DBMSCs對PBMCs增殖抑制作用;流失細(xì)胞儀分析MLCs中淋巴細(xì)胞的凋亡情況及Treg細(xì)胞(CD4+CD25high)比例;實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR)檢測MLCs中DBMSCs可溶性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、白介素-10（IL-10）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)

18、、環(huán)氧化酶-2(COX-2)、吲哚胺2，3雙加氧酶(IDO)和人類白細(xì)胞抗原-G(HLA-G)的表達(dá)情況。FMMSCs作為對照。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±SD）方式進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)描述;多組間比較采用單向方差分析，DBMSCs體外生長動力學(xué)分析采用析因設(shè)計資料的方差分析，兩個獨(dú)立樣本的均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，可溶性細(xì)胞因子表達(dá)部分采用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:通過描繪早

19、期代數(shù)DBMSCs生長曲線圖，結(jié)果提示DBMSCs在經(jīng)過11天的潛伏期后進(jìn)入對數(shù)生長期，且自此往后的檢測點(diǎn)(d11、d14、d18、d20)，其細(xì)胞數(shù)量明顯高于FMMSCs(p＜0.05);整個過程中DBMSCs始終保持上升的生長勢頭，而FMMSCs在末期生長表現(xiàn)為下降的趨勢。經(jīng)過3個月的長期連續(xù)培養(yǎng)，我們獲取了第16-24代晚期DBMSCs。原子力顯微鏡觀察下DBMSCs呈長梭型，部分可見大的扁平狀細(xì)胞，可見與細(xì)胞長軸平行的微絲束，細(xì)

20、胞骨架明顯，由微管、微絲、中間纖維形成立體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，邊緣復(fù)雜，有觸突狀骨架伸出，對維持細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞的運(yùn)動和物質(zhì)運(yùn)輸起著關(guān)鍵的作用。細(xì)胞核大，核膜清晰，核仁明顯，部分細(xì)胞核可見多個核仁。細(xì)胞間連接也可見微管及微絲結(jié)構(gòu)，形成細(xì)胞間的網(wǎng)狀連接，提示細(xì)胞間存在相互通訊和物質(zhì)交換的可能。透射電鏡顯示細(xì)胞呈長梭形，細(xì)胞膜完整，在高倍鏡下，細(xì)胞表面可見散在的豐富的類似微絨毛結(jié)構(gòu)，可能與胎盤固有的附著能力有關(guān)。細(xì)胞間的連接以緊密連接為主，部分區(qū)域

21、可見縫隙連接，說明細(xì)胞間存在粘合和通訊的交互作用。細(xì)胞多為單核，偶見雙核，核漿比例大，核膜清晰，外膜外表面附有核糖體，具有合成蛋白質(zhì)的功能，核仁一個或多個，由核仁絲纏繞成海綿球體狀，少量的異染色質(zhì)分布在核周邊區(qū)，常染色質(zhì)占多數(shù)，是間期核處于伸展部位的染色質(zhì)，電子密度低，利于RNA的復(fù)制，部分細(xì)胞可見核仁邊集現(xiàn)象，這可以使核仁合成的各種RNA更迅速的釋放在胞質(zhì)中，表明細(xì)胞代謝活躍。胞漿內(nèi)可見散在的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其上附著豐富的游離核糖體，說明

22、正在大量合成細(xì)胞分裂和生長所需的蛋白質(zhì)，這從側(cè)面反應(yīng)了細(xì)胞增殖活躍，細(xì)胞分化程度較低。細(xì)胞的線粒體為管狀嵴結(jié)構(gòu)，與內(nèi)分泌細(xì)胞的線粒體的超微結(jié)構(gòu)相似。染色體核型分析結(jié)果顯示:所有受檢的晚期代數(shù)DBMSCs樣本均和早期代數(shù)細(xì)胞一樣保持正常染色體核型(46，XX);由于所有胎盤樣本均來自與男性胎兒，此結(jié)果也側(cè)面反應(yīng)了我們所分離的細(xì)胞單純來源于母體組織，而并未受胎兒組織細(xì)胞的污染。MLCs實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:無論細(xì)胞-細(xì)胞接觸方式和Transwell

23、，DBMSCs類似FMMSCs可抑制促細(xì)胞分裂素和同種異源誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖，并且呈濃度依賴性。流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI染色檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示:MLCs對照和共培養(yǎng)體系中淋巴細(xì)胞未見明顯的凋亡，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=-1.340，P=0.229）。流式細(xì)胞儀分析與DBMSCs共培養(yǎng)后CD4+CD25high細(xì)胞的變化情況，結(jié)果顯示:MLCs體系中經(jīng)PHA刺激，與DBMSCs共培養(yǎng)3天后，CD4+CD25high細(xì)胞比例相比

24、對照組增高了5倍以上。Q-PCR結(jié)果提示:除TGF-β(Z=-0.289, P=0.773)外，IL-10(Z=-2.309, P=0.021)、iNOS(Z=-2.309, P=0.021)、COX-2(Z=-2.309,P=0.021)、IDO(Z=-2.309,P=0.021)和HLA-G(Z=-2.309,P=0.021)等抗炎因子的表達(dá)量相比未處理DBMSCs明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論:人胎盤底蛻膜間充

25、質(zhì)干細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖活性，體外長期連續(xù)培養(yǎng)可保持穩(wěn)定正常的染色體核型，且具有明顯的免疫抑制作用，是干細(xì)胞移植治療良好的細(xì)胞種子來源。
　　 第三章人胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞向多巴胺能樣神經(jīng)元分化
　　 目的:探討人胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化為多巴胺能樣神經(jīng)元的潛能，并分析這種潛能是否受長期培養(yǎng)影響.進(jìn)而評價其在PD治療方面的應(yīng)用前景。
　　 方法:采用早期第3代和經(jīng)長期培養(yǎng)3個月后第19代單細(xì)胞來源DBMSC

26、s依照兩步法進(jìn)行誘導(dǎo)。第一步:神經(jīng)球(NSs)誘導(dǎo)，細(xì)胞換新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基孵育過夜，胰蛋白酶消化后用含表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和B27等細(xì)胞因子的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)。同時，通過光學(xué)顯微鏡下分別計數(shù)兩種不同代數(shù)細(xì)胞的成球率來評價他們的成球能力。第二步:DA神經(jīng)元誘導(dǎo)，將NSs消化成單個細(xì)胞后，用含音猬因子(SHH)、成纖維細(xì)胞生長因子8(FGF8)、腦源性生長因子(BDNF)和毛猴素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸后接種于

27、層粘連蛋白包被的培養(yǎng)板中連續(xù)誘導(dǎo)7-10天。第一步誘導(dǎo)后光學(xué)顯微鏡下觀察NSs形態(tài)和生長特點(diǎn)，免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot檢測神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)標(biāo)記Nestin和CD133的表達(dá);第二部誘導(dǎo)后光學(xué)顯微鏡下觀察DA神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)改變，免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot檢測成熟神經(jīng)元標(biāo)記神經(jīng)特異性的烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和DA神經(jīng)元特異性標(biāo)記酪胺酸羥化酶(TH)的表達(dá)情況。采用圖像分

28、析軟件分析Western blot條帶灰度，以β-actin作為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參。電化學(xué)-高效液相色譜法分析誘導(dǎo)前后培養(yǎng)上清中DA含量變化。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±SD）方式進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)描述;早、晚期代數(shù)來源的NSs成球能力及DA神經(jīng)元神經(jīng)遞質(zhì)分泌量比較采用兩個獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，早、晚期代數(shù)DBMSCs來源的DA神經(jīng)元標(biāo)記表達(dá)率比較采用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:當(dāng)DBMSCs經(jīng)過第

29、一步NSs誘導(dǎo)后，起初幾天大多數(shù)細(xì)胞仍呈貼壁生長，在第3天開始出現(xiàn)小的細(xì)胞團(tuán)，這些細(xì)胞團(tuán)（并非所有）體積逐漸增大，約8-10天形成漂浮生長的細(xì)胞球，第3代和第19代細(xì)胞來源的NSs光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)上無差異，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測提示兩種不同來源的NSs均高表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記Nestin和CD133，Western blot結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果相符。而晚期代數(shù)DBMSCs來源的NSs形成數(shù)量明顯低于早期代數(shù)來源的NSs（3.889±0.

30、674 vs6.778±0.752），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.958，p=0.000)。當(dāng)NSs經(jīng)過第二步DA神經(jīng)元誘導(dǎo)后，細(xì)胞呈現(xiàn)出長梭形分枝狀的神經(jīng)元樣形態(tài)，兩種代數(shù)來源的神經(jīng)元祥細(xì)胞均表達(dá)成熟神經(jīng)元標(biāo)記NSE（62.250±4.935 vs56.650±6.890％，Z=-1.441，p=0.180）、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記GFAP(42.800±6.160 vs40.867±10.686％，Z=-0.641，p=0.589)和DA

31、神經(jīng)元特異性標(biāo)記TH（19.050±5.585 vs17.233±2.680％，Z=-0.320，p=0.818）。Western blot結(jié)果同樣證實(shí)了TH蛋白的表達(dá)，且電化學(xué)-高效液相結(jié)果顯示:相比誘導(dǎo)前，兩種不同來源細(xì)胞誘導(dǎo)后培養(yǎng)上清DA含量均有升高(P3:t=-23.002，p=0.000; P19:t=-15.756，p=0.000)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。此外，兩種不同代數(shù)細(xì)胞誘導(dǎo)前后DA分泌量（P3 vs P19:156.0